1. Traitement des neurones
Remarque : Le traitement a été effectué à la Division (DIV) 7. Toutes les étapes sont réalisées sous une hotte de culture cellulaire dans des conditions stériles. La figure 1 illustre un exemple de densité de culture neuronale corticale à la DIV 7.
- Agrégats αS associés à des microsomes de pool obtenus à partir de la moelle épinière de trois souris transgéniques malades différentes pour obtenir une solution de 1 μg/μL, à l’aide du tampon d’homogénéisation d’origine [composé de 250 mM de saccharose, 20 mM d’acide HEPES (4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique), 10 mM de KCl (chlorure de potassium), 1,5 mM de MgCl2 (chlorure de magnésium), 2 mM d’EDTA (acide éthylènediaminetétraacétique), et 1x inhibiteurs de la phosphatase/protéase] pour la dilution.
- Effectuer une culture de neurones sur des lamelles de poly-D-Lysine dans des plaques de 24 puits contenant du milieu (2 % de B27, 10 x gentamicine et 2 mM de glutamine). Retirez 1/3 du milieu et remplacez-le délicatement par le milieu frais contenant 2 % de B27, 1x gentamicine et 2 mM de glutamine.
- Ajouter 1 μg d’agrégats d’alpha-synucléine (αS) associés à des microsomes mélangés au milieu cellulaire. Renvoyez les neurones dans l’incubateur à 37 °C.
- Tous les 3 jours pendant 1 semaine, ajoutez 1/3 de milieu frais. Ne remplacez pas le fluide. Il suffit de l’ajouter.
- Après 1 semaine de traitement, prélever 1/3 du milieu et le remplacer délicatement par le milieu frais contenant 2 % de B27, 10 μg/mL de gentamicine et 2 mM de glutamine. Répétez l’opération tous les 3 jours.
- Fixer les neurones après 2 semaines de traitement (DIV 21).
2. Immunofluorescence
- Fixez les neurones avec 2 % de paraformaldéhyde dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x et une solution de saccharose à 5 % pendant 15 min à température ambiante (RT) sans agiter sous une hotte chimique.
- Retirez la solution de fixation. Laver brièvement avec PBS 1x, 3 fois.
note: Effectuez toutes les étapes de lavage en douceur car les neurones primaires n’adhèrent pas fermement aux lamelles en polylysine.
- Perméabiliser les neurones avec 0,3 % de surfactant non ionique dans PBS 1x pendant 5 min à RT.
- Laver brièvement avec PBS 1x, 3 fois.
- Incuber des neurones avec 3 % de sérum de veau fœtal (FBS) dans PBS 1x pendant 30 min à RT pour bloquer les sites de liaison non spécifiques sur un agitateur orbitaire.
- Incuber des neurones avec l’anticorps primaire approprié dissous dans 3 % FBS dans PBS 1x, O/N à 4 °C sur un agitateur orbitaire.
REMARQUE : Des anticorps αS (1:1 000), αS (1:200), pser129-αS (1:1 000) et Tau (1:10 000) ont été utilisés.
- Retirez la solution d’anticorps et lavez, brièvement, avec du PBS 1x, 3 fois.
- Incuber des neurones avec un anticorps secondaire fluorescent approprié dissous dans 3 % FBS dans PBS pendant 1 h à RT dans l’obscurité sur un agitateur orbitaire.
- Retirez la solution d’anticorps et lavez, brièvement, avec du PBS 1x, 3 fois.
- Colorer les neurones avec une solution de DAPI (4′,6-diamidino-2-phénylindole) (0,1 μg/mL dans du PBS 1x) pendant 15 min à RT dans l’obscurité sur un agitateur orbital.
- Retirez la solution d’anticorps et lavez, brièvement, avec du PBS 1x, 3 fois.
- Montez les lamelles sur une glissière à l’aide d’un support de montage anti-décoloration.
