Un modèle in vitro de lésions d’étirement dans des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes humaines induites

Résumé

Source : Phillips, J. K. et al. Méthode pour les lésions par étirement à grande vitesse de neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans un format à 96 puits. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo démontre le processus d’induction de lésions d’étirement sur les neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSCN). Les cellules sont prélevées dans une plaque multi-puits sans fond avec une membrane de silicone attachée. Une contrainte mécanique contrôlée est appliquée sur la membrane pour induire une perturbation cytosquelettique et des dommages à la membrane cellulaire, induisant un phénotype de lésion par étirement dans les cellules.

Protocole

1. Fabrication de plaques

1. Traitez au plasma une plaque supérieure de 96 puits avec un nettoyeur plasma de 200 W (voir tableau des matériaux) pendant 60 s à haute puissance, en le plaçant du bas vers le haut à l’intérieur du nettoyeur plasma. Vérifiez qu’une lueur violette est visible à travers la fenêtre de la chambre, ce qui indique qu’un plasma efficace s’est formé. Cette technique de collage est adaptée de Sunkara et al.
2. Dans les 60 s, placer le dessus de la plaque dans 200 mL de triéthoxysilane à 1,5 % (3-aminopropyle) (APTES) dans de l’eau désionisée (DI) pendant 20 min, le dessous vers le bas. Cette solution est instable : ne la préparez pas plus de 60 s avant d’introduire la plate.
   prudence: Travaillez avec APTES dans une hotte.
3. Le plasma traite une membrane de silicone extraite dans le nettoyeur plasma pendant 60 s à haute puissance. Chronométrez le traitement au plasma de manière à ce qu’il ne se termine pas plus de 5 minutes avant la fin de la période de 20 minutes à l’étape 1.2.
4. À l’aide d’une pince, placez la membrane traitée au plasma sur un rectangle de papier parchemin de^7,5 x 11 cm 2. Alignez une plaque d’aluminium de 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm sur la partie inférieure de la pince de fabrication de la plaque. Alignez la membrane de silicone et le papier sulfurisé sur la plaque d’aluminium à l’aide d’une pince.
5. Retirez les dessus des plaques du bain APTES et secouez l’excès de solution. Tremper dans un bain-marie DI de 200 mL pendant 5 s et secouer l’excès d’eau. Tremper dans un autre bain-marie de 200 ml pendant 5 secondes et secouer l’excès d’eau. Remplacez l’eau de ces bains avant de tremper une autre plaque sur le dessus.
6. Utilisez de l’air comprimé pour sécher complètement le dessus de la plaque.
7. Placez le dessus de la plaque dans la partie supérieure de la pince de fabrication de plaque. Fermez doucement la pince de fabrication de la plaque pour presser le dessus de la plaque et le silicone ensemble. Pince pendant au moins 1 h.
8. Laisser durcir la plaque pendant 24 h à température ambiante avant utilisation, à l’abri de la poussière.

2. Étirer une plaque

1. Nettoyer les pénétrateurs
   1. Préparez un sonicateur de 60 W avec de l’eau DI à température ambiante.
   2. Soutenir le bloc de pénétrateur au-dessus du bain de sonisation, inversé de manière à ce que seuls les sommets des pénétrateurs soient immergés à une profondeur d’au moins 1 mm. Soniquer les pénétrateurs pendant 8 min à 42 kHz.
   3. Séchez les pénétrateurs au sèche-cheveux avec de l’air comprimé.
2. Aligner le bloc de pénétrateur
   1. Placez une caméra avec un flux en direct au-dessus du dispositif d’étirement de sorte qu’elle regarde vers le bas sur le réseau de pénétrateurs. Focus sur les sommets des pénétrateurs.
      note: La configuration décrite dans la section 3, « Caractérisation de l’étirement de la membrane », est une configuration de caméra possible pour cette tâche.
   2. Fixez une plaque sur la platine du dispositif de blessure à l’aide des pinces de platine (Figure 1) et placez un plafonnier sur le dispositif.
      note: Voir le tableau des matériaux pour le logiciel de contrôle de l’instrument.
   3. Lancez le logiciel de contrôle de l’instrument en cliquant sur l’icône du logiciel sur le bureau de l’ordinateur qui contrôle le dispositif de blessure. Lancez le projet « in_vitro_neurotrauma.lvproj » en cliquant dessus dans la fenêtre de lancement. À partir de la fenêtre du projet, lancez les instruments virtuels (VI) de contrôle de mouvement et de suivi de position, nommés respectivement « motion_control.vi » et « position_tracker.vi », en double-cliquant dessus.
   4. Fermez la cage entourant l’appareil de blessure. Appuyez sur le bouton « flèche » dans le coin supérieur gauche du VI de contrôle de mouvement pour exécuter le VI et cliquez sur « Near Bottom » pour abaisser la platine à moins de 2 mm du contact avec les pénétrateurs. Cliquez sur le bouton 'Stop' pour arrêter le VI.
      prudence: Gardez les mains à l’écart de la civière lorsque vous manipulez la caméra dans la cage. La cage doit être équipée d’un interrupteur de porte qui alimente le dispositif d’étirement uniquement lorsque la porte de la cage est fermée.
   5. Dans la fenêtre du projet, faites un clic droit sur 'Axe 1'. Cliquez sur « Panneau de test interactif ». Dans la fenêtre qui s'ouvre, réglez la taille du pas sur 50 μm en saisissant les unités « 500 » dans le champ « Position cible ».
   6. Cliquez plusieurs fois sur le bouton vert « Go » en bas de la fenêtre « Panneau de test interactif » jusqu'à ce que la plaque entre en contact pour la première fois avec des pénétrateurs. Vérifiez qu’il y a contact sur l’image en direct affichée par la caméra. Notez la position verticale de la scène indiquée en haut à gauche de la fenêtre « Panneau de test interactif » ; Il s’agit de la position de premier contact.
   7. Abaissez davantage (comme décrit à l’étape 2.2.6) jusqu’à ce que chaque puits soit entré en contact avec les pénétrateurs. Si nécessaire, déplacez la caméra pour voir l'ensemble de la plaque et déplacez la platine vers le haut (en spécifiant une « position cible » négative) et vers le bas. Notez la position verticale de la platine indiquée en haut à gauche de la fenêtre lorsque tous les poteaux sont en contact (il s’agit de la position de contact complet).
   8. Notez la différence entre la position du premier contact et la position de contact complet. Fermez le « Panneau de test interactif ». Exécutez le 'contrôle de mouvement VI' (voir étape 2.2.4) et cliquez sur 'Top' pour soulever la scène. Arrêtez le VI de contrôle de mouvement avec le bouton 'Stop'.
   9. Une fois que l’étape est au sommet de sa course, ouvrez la porte pour désactiver l’appareil. Ajustez les vis de réglage sur les coins du bloc de pénétrateur. Desserrez la vis de réglage sur le coin qui est entré en contact en premier, pour l’abaisser et serrez la vis opposée pour relever le coin qui a fait durer le contact.
   10. Répétez le processus d’abaissement de la platine jusqu’à ce que la plaque entre en contact avec les pénétrateurs, en inspectant les images de contact pour l’inclinaison, en soulevant la platine et en ajustant (étape 2.2.9) le bloc du pénétrateur. Lorsque la platine et le bloc sont alignés, tous les pénétrateurs entrent en contact en même temps.
   11. Ouvrez la porte pour désactiver l’appareil. Insérez les vis d’arrimage dans leurs trous sur le bloc de pénétrateur et serrez-les. Vérifiez que le bloc est de niveau avec les vis d’arrimage en place (étapes 2.2.4 à 2.2.8). Prenez note de la position de la platine signalée par le « panneau de test interactif » lorsque la plaque entre en contact. Ce sera la position zéro pour les expériences d’indentation.
3. Lubrifier les pénétrateurs
   1. Si le bloc de pénétrateur vient d’être installé et n’a pas encore été lubrifié, nettoyez un tampon en caoutchouc solide (7,5 cm x 11 cm x 1,5 mm) et un tampon en caoutchouc mousse souple à cellules fermées (7,5 cm x 11 cm x 3 mm) avec une lingette de laboratoire imbibée d’éthanol. Laissez-les sécher à l’air libre.
   2. Trempez une lingette de laboratoire dans de l’huile de maïs et étalez-la sur le tampon en caoutchouc solide jusqu’à ce qu’elle devienne terne.
   3. Placez le tampon en mousse sur le tampon en caoutchouc solide pour transférer l’huile sur le tampon en mousse. Placez une plaque d’aluminium de 7,5 cm x 11 cm x 0,5 cm sur le tampon en mousse et chargez-la d’un lest d’environ 360 g (p. ex., 6 tubes coniques chargés de 45 ml d’eau chacun) pour assurer un transfert uniforme de l’huile du tampon en caoutchouc solide au tampon en mousse. Attendez 10 s pour que l’huile se transfère sur le tampon en caoutchouc mousse.
   4. Déplacez le tampon en caoutchouc mousse sur le pénétrateur. Placez la plaque d’aluminium et le poids de ballast sur celle-ci pour assurer un transfert constant de l’huile vers les extrémités des pénétrateurs. Comptez 10 s pour que l’huile se transfère vers les pénétrateurs.
   5. Si aucune plaque n’a été étirée depuis que le bloc de pénétrateur a été installé et lubrifié pour la première fois, étirez une plaque d’essai avant de commencer l’expérience. Remarque : Cela permettra d’éviter qu’une incohérence entre le premier étirement et les suivants ne perturbe l’expérience. Pour les étirements suivants, répétez uniquement les étapes 2.3.2 à 2.3.5 avant chaque étirement.
4. Étirer une assiette
   1. Lubrifiez les pénétrateurs comme décrit à l’étape 2.3.
   2. Fixez la plaque sur la platine du dispositif de blessure à l’aide des pinces de platine. Si la stérilité est requise, ajustez la position du couvercle pour fixer la plaque sans exposer la surface de culture à l’air ambiant.
   3. Abaissez la platine en position zéro à l'aide de la « commande de mouvement VI » (voir étapes 2.2.4-2.2.6) ; la position zéro est déterminée à l'étape 2.2.
   4. Remplacez le nom du fichier dans le champ « chemin d'accès au fichier » du « VI de suivi de position » par un nom de fichier unique, puis exécutez-le avec le bouton « flèche » dans le coin supérieur gauche de cette fenêtre.
   5. Réglez la profondeur et la durée de l'indentation (généralement de 1 à 4 mm et 30 ms, respectivement, profondeur maximale de 5 mm, durée minimale de 15 ms) dans les champs « Blessure (mm) » et « Durée de la blessure (ms) » dans le « Panneau de contrôle des mouvements VI » en cliquant sur les champs et en saisissant les valeurs souhaitées.
   6. Exécutez le 'Panneau de contrôle de mouvement VI' et cliquez sur 'Blesser' pour mettre la plaque en retrait.
   7. Déplacez l'étape jusqu'en haut de son parcours en cliquant sur « Top ». Arrêtez ensuite le VI à l'aide du bouton « Stop » et désactivez le dispositif de blessure en ouvrant la porte.
   8. Inspectez l'historique de déplacement de l'étage présenté dans le « suivi de position VI » pour confirmer que le déplacement maximum spécifié a été appliqué. Faites un clic droit sur le graphique et cliquez sur « exporter vers Excel ». Cliquez sur 'Fichier| Enregistrer' pour sauvegarder les données.

3. Caractérisation de l’étirement de la membrane

1. Peignez l’évidement en haut de chaque pénétrateur en blanc pour fournir un arrière-plan très contrasté pour la vidéographie à grande vitesse. Attention : Ne peignez pas les jantes des pénétrateurs là où ils entrent en contact avec des plaques.
2. Imprimez en 3D avec du poly(acide lactique) (PLA), ou fabriquez autrement, un tampon cylindrique avec lequel faire un point dans chaque puits. Réalisez le cylindre de 5,9 mm de diamètre et 12,2 mm de haut, avec une saillie cylindrique de 1,5 mm de diamètre et 1,0 mm de haut centrée sur le dessus.
3. Le plasma traite la plaque à l’endroit pour activer la surface de culture cellulaire de silicone dans les puits pendant 60 s, comme mentionné à l’étape 2.1.
4. Placez la plaque sur un tampon en caoutchouc ou une autre surface molle. Apprêtez la petite saillie du tampon (voir étape 1.2) avec de l’encre provenant d’un marqueur permanent. Insérez le tampon dans le puits à tester et tapotez pour assurer un bon transfert d’encre. Amorcez le tampon avant chaque puits.
5. Alignez le bloc de pénétrateur et lubrifiez les pénétrateurs du dispositif blessé (voir étapes 2.2-2.3). Fixez la plaque sur la platine du dispositif de blessure. Placez une lumière axiale diffuse brillante au-dessus du dispositif de blessure.
6. Installez une caméra haute vitesse sur un support de perche au-dessus de l’appareil blessé, tournée vers le bas, avec l’objectif réglé sur le plus petit f-stop numéroté, et allumez-la. Lancez le logiciel de l’appareil photo sur l’ordinateur connecté à l’appareil photo. Dans le menu déroulant de la fréquence d’images, sélectionnez 2 000 images par seconde, et dans le menu déroulant de l’obturateur, sélectionnez le temps d’exposition le plus rapide qui donne des images à contraste élevé. Centrer sur les puits pointillés.
   1. Positionnez la caméra de manière à ce que le champ de vision contienne 12 puits dans une grille 3 x 4.
      note: Ce champ de vision offre un compromis optimal entre débit et résolution pour une image de 1 280 × 1 024.
7. Abaissez la plaque jusqu’au point zéro (voir étapes 2.2.4 à 2.2.6). Cliquez un clic sur le bouton d'enregistrement du logiciel de l'appareil photo pour qu'il indique « trigger in ». Lancez le suivi de position VI (étape 2.4.4).
8. Allumez la lumière axiale diffuse brillante. Indentez la plaque comme décrit à l’étape 2.4.6.
9. Désactivez la lumière axiale diffuse brillante.
10. Sur l’ordinateur de contrôle de la caméra, recherchez la fenêtre de 30 à 40 ms de l’enregistrement dans laquelle l’indentation se produit : faites glisser les flèches de début et de fin dans la barre de lecture vidéo haute vitesse du logiciel de la caméra. Cliquez sur Enregistrer, définissez le nom dans le champ « Nom du fichier », sélectionnez « TIFF » dans le champ « Format », puis cliquez sur « Enregistrer ».
    1. Regardez à travers le . Fichiers TIF pour les images des états les moins étirés (début) et les plus étirés (indentation de pointe).
    2. Pour mesurer la hauteur et la largeur des points dans les deux images, utilisez Fidji pour ouvrir les images du plus petit et du pic s’étirer côte à côte. À l’aide de l’outil de sélection rectangulaire par défaut, cliquez et faites glisser pour dessiner une zone autour d’un point dans l’image la moins étirée. Mesurez la hauteur et la largeur avec 'Analyze| Mesurer ».
    3. Répétez l’opération pour le point dans le même puits sur l’image d’étirement de pointe. Répétez l’opération pour le reste des puits.
11. Calculez la déformation lagrangienne dans les directions x et y comme suit :
    4. Placage des cellules cultivées
    1. Autoclavez les bacs et les poids de ballast qui seront utilisés pour la stérilisation.
    2. Traiter au plasma les plaques à fond de silicone à l’endroit pendant 60 s (voir étape 1.1). Immergez immédiatement les plaques dans des bacs stériles contenant 70 % d’éthanol pendant 15 min.
    3. Immerger les plaques dans une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS) dans des bacs stériles séparés pendant 30 min.
    4. Aspirer le PBS des puits. Ne séchez qu’une seule plaque à la fois pour éviter que les puits ne perdent le traitement plasma.
       prudence: Les plaques à fond en silicone offrent moins de retour tactile que les plaques rigides lors du pipetage et sont plus susceptibles de bloquer la pointe d’une pipette.
    5. Ajouter 100 μL de poly-L-ornithine (PLO) 0,1 mg/mL par puits dans les plaques stérilisées. Incuber à température ambiante pendant 1 h.
    6. Rincez les puits deux fois avec 100 μL de PBS stérile, en laissant le deuxième lavage sur les puits jusqu’à ce que la suspension cellulaire soit prête.
    7. Retirez le flacon de hiPSCN du stockage de l’azote liquide à l’aide de gants de sécurité et placez-le sur de la glace sèche. Transportez rapidement le flacon dans un bain-marie à 37 °C et décongelez-le pendant exactement 3 min. Ne faites pas tourner le flacon.
    8. Dans une hotte stérile, transférez délicatement le contenu du flacon dans un tube conique de 50 ml à l’aide d’une pipette sérologique de 1 ml.
    9. Rincer le flacon cryogénique vide avec 1 mL de milieu d’entretien complet à température ambiante (base de milieu + supplément).
    10. Transférez 1 mL de média dans le tube de 50 mL goutte à goutte à raison d’environ une goutte par seconde. Faites tourner doucement le tube tout en l’ajoutant. Ajoutez 8 ml de produit d’entretien complet à température ambiante dans le tube de 50 ml à environ 2 gouttes/s.
    11. Fermez le tube et retournez-le 2 à 3 fois. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Calculez le volume de milieu supplémentaire nécessaire pour diluer la suspension de cellules à 225 000 cellules/ml.
    12. Pipeter doucement la quantité de milieu (calculée ci-dessus) dans le tube de suspension cellulaire à l’aide d’une pipette sérologique de 25 ml.
    13. Ajouter 10 μL de laminine 1 mg/mL par 1 mL de suspension cellulaire à l’aide d’une micropipette de 1 000 μL pour obtenir 10 μg/mL de laminine dans la suspension cellulaire. Aspirez une fois de haut en bas avec l’embout utilisé pour la laminine, puis bouchez le tube et retournez le tube une fois.
    14. Aspirez le PBS des plaques, une plaque à la fois. À l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez 100 μL de suspension cellulaire hiPSCN dans chaque puits. Les puits ont une surface de culture de 0,33^cm2, de sorte que la densité cellulaire par zone est de 67 500 cellules/^cm2.
    15. Laisser reposer les plaques à température ambiante pendant 15 min après le semis pour favoriser la fixation. Pour éviter les vibrations du ventilateur du capot de culture stérile, placez les plaques couvertes sur la paillasse du laboratoire. Incuber les cultures à 37 °C avec 5 % de CO₂.
    16. Effectuez un changement complet de média à 24 h, en remplissant les puits avec 200 μL de média d’entretien complet. Effectuez un demi-changement de milieu de 100 μL/puits tous les 2-3 jours.

    5. Endommager les cultures

    1. Alignez le bloc de pénétrateur et trouvez la position zéro comme décrit à l’étape 2.2. Lubrifiez les pénétrateurs comme décrit à l’étape 2.3.
    2. Définissez le nom de fichier pour l'historique des déplacements dans le 'suivi de position VI' (étape 2.4.4). Réglez les paramètres de blessure dans le « contrôle de mouvement VI » (étape 2.4.5).
    3. Sortez la plaque à blesser de l’incubateur et fixez-la sur la scène. Ajustez la position du couvercle pour fixer la plaque sans exposer les cultures à l’air ambiant.
    4. Abaissez la plaque jusqu'au point zéro (étapes 2.2.4-2.2.6) à l'aide de la « commande de mouvement VI ». Démarrez le « suivi de position VI » (étape 2.4.4).
    5. Utilisez la commande de mouvement VI pour indenter la plaque (comme décrit à l’étape 2.4.6). Pour les étirements fictifs, sautez uniquement cette étape.
    6. Remettez la platine au sommet de son amplitude de mouvement (voir étape 2.4.7). Remettez la plaque dans l’incubateur.
    7. Inspectez et enregistrez le tracé de déplacement (comme à l’étape 2.4.8).

Résultats

Figure 1 : Schéma étiqueté du dispositif de blessure.(A) Vue de dessus, (B) vue isométrique, (C) vue de face, (D) vue latérale droite. La barre d’échelle s’applique aux vues orthographiques (A, B et D).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Feuille de silicone .010"	Fabrication spécialisée, Inc	#70P001200010	Feuille de polydiméthylsiloxane (PDMS)
Étincelle	Fisher Scientific	#043204
Nunc 256665	Fisher Scientific	#12-565-600	Plaque sans fond à 96 puits
Lingettes Kim	ULINE	S-8115
Nettoyeur plasma	Plasma de Harrick	#PDC-001-SC
(3-aminopropyl) triéthoxysilane	Sigma-Aldrich	Réf. 440140	APTES
Papier sulfurisé	Reynolds	n/a
Plafonnier	CCS inc	LFX2-100SW
Alimentation du dôme	CCS inc	Réf. PSB-1024VB
Unité d’éclairage diffus axial	siemens	Nerlite DOAL-75-LED	Lumière axiale diffuse
Réseau de LED haute puissance	cree	XLamp CXA2540	Réseau de LED haute puissance
Support LED	Molex	1807200001	Support LED
Alimentation LED	Bien méchant	HLG-320H-36B	Alimentation à courant constant
Logiciel FastCam Viewer	Photron		Camera Softeware
Fastcam Mini UX50	Photron	n/a	Caméra haute vitesse
Micro-NIKKOR 105mm f/2.8	Nikon	Réf. 1455	Objectif de caméra haute vitesse
0,1 mg/mL de poly-L-ornithine	Sigma-Aldrich	#P4597
iCellules	Dynamique cellulaire internationale	#NRC-100-010-001
Supports iCell	Dynamique cellulaire internationale	#NRM-100-121-001
Supplément iCell	Dynamique cellulaire internationale	#NRM-100-031-001
Laminine	Sigma-Aldrich	#L2020
actionneur à bobine mobile	BEI Kimco	LA43-67-000A
Codeur linéaire optique	Renishaw	Réf. T1031-30A
servomoteur	Commandes Copley	Xenus XTL
contrôleur	National Instruments	cRIO 9024 Contrôleur PowerPC en temps réel
Châssis cRIO	National Instruments	cRIO 9113
Module d’entrée numérique	National Instruments	NI 9411
Acquisition de données châssis	National Instruments	NI 9113
LabVIEW	National Instruments
hiPSCN	Dynamique cellulaire internationale