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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Animaux
- Maintenir la souche de poisson-zèbre TgBAC (gfap :gfap-GFP) âgée entre 6 et 9 mois dans des conditions standard dans une eau à une température de 26,5 °C et un cycle lumière/obscurité de 14/10 h.
2. Anesthésie systémique réversible
- Préparez la solution mère de sel de méthanesulfonate d’éthyle 3-aminobenzoate (tricaïne) en dissolvant 400 mg de poudre de tricaïne dans 97,9 mL d’eau du réservoir et 2,1 mL de 1 M de solution saline tamponnée au tris (TBS). Ajuster à pH 7,0 avec 1 M Tris (pH 9) et conserver à 4 °C dans l’obscurité jusqu’à un mois.
note: La tricaïne doit être préparée dans l’eau selon les conditions de vie naturelles de l’animal, de préférence de l’eau de réservoir d’origine doit être utilisée.
- Diluer la solution mère à 1:25 dans l’eau du réservoir et l’utiliser immédiatement.
- Placez le poisson-zèbre dans une boîte de Pétri de 10 cm contenant 50 ml de solution d’anesthésie jusqu’à ce qu’il devienne immobile et ne réponde plus aux stimuli externes (environ 2 à 5 min, selon le poids et l’âge).
- Transférez chaque poisson à la main dans un porte-épingle en silicone sur mesure pour le traitement au laser (Figure 1A).
prudence! Les poissons peuvent rester anesthésiés à l’extérieur de l’aquarium jusqu’à 10 minutes seulement.
- Pour inverser l’anesthésie après le traitement et/ou l’imagerie, placez le poisson-zèbre dans un récipient contenant de l’eau du réservoir.
- Pour favoriser le rétablissement, créez un écoulement d’eau douce du réservoir sur les branchies en déplaçant le poisson-zèbre d’avant en arrière dans l’eau.
3. Lésion focale laser sur la rétine
REMARQUE : Un laser à diode de 532 nm est utilisé pour créer des dommages à la lumière focale sur la rétine du poisson-zèbre. Le dispositif expérimental du laser permet d’établir une lésion rétinienne focale reproductible chez le poisson-zèbre adulte.
- Réglage de la puissance de sortie du laser : 70 mW ; diamètre de l’antenne : 50 μm ; durée d’impulsion : 100 ms.
prudence! L’utilisation de la lumière laser nécessite une protection individuelle appropriée et un étiquetage de la zone.
- Appliquez 1 à 2 gouttes d’hydroxypropylméthylcellulose à 2 % par voie topique dans l’œil avant le traitement et utilisez une lentille laser de fond d’œil de 2,0 mm pour focaliser le faisceau de visée laser sur la rétine.
prudence! Les gouttes d’hydroxypropylméthylcellulose sont visqueuses et peuvent causer des problèmes respiratoires si elles vont sur les branchies.
- Placez quatre points laser autour du nerf optique de l’œil gauche et utilisez l’œil droit, non traité, comme contrôle interne.
