Mesure de l’activation des récepteurs odorisants à l’aide d’un dosage cyclique en temps réel de l’adénosine monophosphate

Résumé

Source : Zhang, Y. et al., Mesure de l’activation des récepteurs odorants sur cellule vivante à l’aide d’un test d’AMPc en temps réel. J. Vis. Exp.(2017)

Cette vidéo montre le protocole de mesure de l’activation des récepteurs odorants dans les cellules transfectées à l’aide d’un biocapteur d’adénosine monophosphate cyclique (AMPc) et de la détection de luminescence. La méthode est appliquée pour étudier les interactions récepteur-ligand et les voies de signalisation dans les neurones olfactifs.

Protocole

1. Stimulation et mesure de l’activité des récepteurs odorants (OR) à l’aide du test cAMP en temps réel

1. Observez les cellules transfectées à l’aide d’un microscope à contraste de phase pour assurer une confluence correcte de 50 à 80 % par puits et retournez-les à l’incubateur.
2. Préparez le milieu de stimulation en ajoutant 10 mM d'acide hydroxyéthyl pipérazinéthanesulfonique (HEPES) et 5 mM de glucose à la solution saline équilibrée de Hank (HBSS).
3. Décongeler les aliquotes en temps réel du substrat du substrat d’AMPc sur de la glace. Stocker le réactif de substrat à -80 °C à 55 μL par tube dans des tubes d’amplification en chaîne par polymérase (PCR). Utilisez 1 tube par plaque.
4. Préparez une solution d’équilibrage à 2 % en mélangeant 55 μL de réactif de substrat et 2750 μL DE SOLUTION HBSS/HEPES/GLUCOSE.
5. Étalez une épaisse couche de papier absorbant sur le banc. Tapotez doucement et à plusieurs reprises l’assiette à l’envers sur l’essuie-tout afin que le fluide de transfection soit complètement absorbé par celui-ci.
6. Lavez les cellules en pipetant 50 μL de solution HBSS/HEPES/glucose dans chaque puits.
7. Tapotez doucement et à plusieurs reprises la solution HBSS/HEPES/glucose de la plaque à 96 puits.
8. Pipeter 25 μL de solution d’équilibrage à 2 % dans chaque puits et incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 2 h.
9. Préparez à l’avance des solutions mères d’odorisant 1 M dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO) et conservez-les à -20 °C jusqu’à ce qu’elles soient utilisées.
10. Avant la fin de la période d’incubation, diluer les solutions mères odorantes à des concentrations de travail dans le milieu de stimulation HBSS/HEPES/glucose.
    note: Les concentrations des dilutions d’odorisant préparées lors de cette étape doivent être doublées pour obtenir les concentrations finales correctes dans chaque puits.
11. À l’aide d’un lecteur de plaque de chimiluminescence et avant l’ajout d’odorant, mesurez le niveau de luminescence basale de la plaque 2 fois consécutives à une vitesse de 1000 ms par puits.
12. Retirez rapidement la plaque du lecteur de plaques, ajoutez des dilutions d’odorisant de 25 μL dans chaque puits et lancez immédiatement la mesure de luminescence continue de tous les puits pendant 20 cycles dans un délai de 30 min
    note: Pipeter avec précaution pour éviter de contaminer les puits voisins lors de l’utilisation de différents odorisants et/ou de différentes concentrations des mêmes odorants dans la même plaque.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Dmso	sigma	D2650
Réactif GloSensor cAMP	Promega	E1290
HBSS, sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium	GIBCO	14175095
HEPES	Hyclone	SH30237
Muscone	Santa Cruz	SC-200528
Musc tibétain	Sigma-Aldrich	S359165
PBS, sans calcium ni magnésium	Cellgro	Référence 21-040-CV
Tube PCR de 0,2 mL	Axygen	PCR-02-C
Tube Eppendorf de 1,5 mL	Eppendorf
Tube conique de 15 mL de 17 mm x 120 mm	BD Faucon	352096
Pipeteur multicanaux à 8 puits et/ou 12 puits	Eppendorf
Plaque de culture de globules blancs à fond plat de 96 puits	Greiner	655098
Boîte de culture cellulaire de 100 mm x 20 mm	BD Faucon	353003
Lecteur de plaques Infinite F200	Técan