Caractérisation de l’espace extracellulaire dans une tranche de cerveau à l’aide de microélectrodes sélectives d’ions et d’ionophorèse

Abstract

Source : Odackal, J., et al. Ionophorèse en temps réel avec du tétraméthylammonium pour quantifier la fraction volumique et la tortuosité de l’espace extracellulaire du cerveau. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo montre comment caractériser l’espace extracellulaire dans une tranche de cerveau en utilisant des microélectrodes sélectives d’ions et d’ionophorèse pour mesurer et comparer les signaux électriques. Ce processus permet de déterminer la fraction volumique de l'espace et le degré de torsion.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Ionophorèse en temps réel dans les tranches de cerveau

1. Placez une tranche de cerveau de 400 m d’épaisseur dans la chambre d’enregistrement, en vous assurant qu’elle est entièrement immergée dans le liquide céphalo-rachidien artificiel en écoulement (ACSF). Positionnez la tranche à l’aide d’un pinceau aquarelle et fixez-la délicatement avec une grille.
2. Déplacez à la fois la microélectrode d’ionophorèse et l’ISM au-dessus du champ d’intérêt sur la tranche de cerveau. Immergez les deux dans l’ACSF qui coule mais au-dessus de la tranche.
3. Décaler la tension pour les voies de référence et de détection ionique à « 0 » mV. Attendez que la tension dans les deux canaux se stabilise. Sur l’enregistreur, marquez la tension mesurée sur le canal de détection ionique de l’ISM. Utilisez ceci pour calculer le paramètre V de référence dans Wanda.
4. Placez les microélectrodes ISM et ionophorèse à 200 μm de profondeur dans la tranche et à 120 μm l’une de l’autre. Attendez la stabilisation du signal après avoir déplacé la microélectrode dans la tranche de cerveau.
   note: Le courant de polarisation appliqué à la microélectrode d’ionophorèse provoque une petite accumulation de tétraméthylammonium (TMA). C’est une erreur courante de prendre un enregistrement trop tôt et de sous-estimer l’accumulation de signal.
5. Sur l’enregistreur, marquez la tension stabilisée mesurée dans la tranche de cerveau sur le canal de détection ionique de l’ISM. Calculez la différence de tension entre le signal TMA mesuré à l’étape 8.3 et à l’étape 8.4 et entrez cette valeur dans le champ « Baseline V (mV) » dans la boîte Électrode de mesure de l’interface graphique Wanda.
6. Sur le côté gauche de l’interface graphique, assurez-vous que tous les paramètres expérimentaux sont correctement enregistrés/saisis. Réglez « Medium » sur « Cerveau », « Transport number » sur la valeur moyenne calculée pour la microélectrode d’ionophorèse à l’étape 7.4 et « Temperature » sur la température du bain contenant la tranche.
   REMARQUE : V doit être enregistré pour chaque série de mesures. La valeur de base V sera convertie par Wanda en paramètre de base C (mM) (c’est-à-dire la concentration de TMA dans le tissu cérébral).
7. Démarrez l’enregistrement en cliquant sur « Acquérir » et laissez-le prendre un enregistrement complet. Attendez que le signal TMA revienne à la ligne de base avant d’acquérir un nouvel enregistrement.
8. Prenez deux à trois enregistrements successifs avant de retirer les microélectrodes de l’endroit cérébral choisi. Entrez la température mesurée dans le logiciel Wanda immédiatement avant chaque enregistrement.
9. Déplacez les deux microélectrodes en diagonale vers la surface de la tranche. Soulevez les deux à au moins 50 μm au-dessus de la tranche. À l’aide de l’enregistreur graphique, déterminez tout changement entre le V mesuré maintenant et sa mesure de l’étape 8.3.
10. Centrez les extrémités de l’ISM et des microélectrodes iontophorétiques les unes par rapport aux autres dans les axes x, y et z. Obtenez les modifications d’espacement, le cas échéant, à partir de l’écran du boîtier de commande du micromanipulateur.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplificateur pour ISM	Dagan	Modèle IX2-700 Double Préamplificateur Intracellulaire	amplificateur de tension ionique et de tension de référence avec étages de tête N=0,1 (pour le barillet de référence) et N=0,001 (pour le barillet d’ions)
Miscroscope à composé biologique (avec objectif 4x et 10x)			pour l’ébréchage des pointes de microélectrodes et l’inspection des microélectrodes ; divers fournisseurs, par exemple AmScope
Tube en verre capillaire thêta borosilicate	Appareil de Harvard	Warner Instruments modèle TG200-4 ; commande #64-0811	tube en verre à double corps pour microélectrodes sélectives d’ions et microélectrodes iontophorétiques ; D.E. 2,0 mm, D.E. 1,4 mm, septum 0,2 mm, longueur 10 cm
enregistreur graphique			pour enregistrer en continu les tensions sur une microélectrode sélective d’ions pendant l’étalonnage dans des étalons de tétraméthylammonium et pendant l’expérience RTI ; par exemple, Kipp & Zonen type BD112 double cannel enregistré graphique, disponible remis à neuf
Logiciels commerciaux	Le MathWorks	MATLAB, boîte à outils d’acquisition de données	pour l’acquisition et l’analyse de données à l’aide des programmes Wanda et Walter. Notez qu’une licence académique est disponible.
lunettes de protection oculaire	pêcheur
microscope composé à platine fixe	Olympe	BX51WI	Peut utiliser d’autres microscopes composés à platines fixes
forceps	Outils scientifiques fins	Réf. 11251-10	pour ébrécher le verre capillaire ; Dumond #5, de préférence utilisé et n’étant plus nécessaire pour les travaux fins
unité iontophorétique	Dagan	ION-100 et PS-100	ION-100 est une unité d’ionophorèse monocanal conforme à +/- 130 V ; Le PS-100 est une alimentation externe ; alternatives : par exemple Axoprobe-1A fabriqué par Axon Instruments (maintenant Molecular Devices), hors production, vérifier la disponibilité des unités remises à neuf (eBay et autres sites)
porte-microélectrode	WPI	M3301EH	pour maintenir un préfabriqué de micro-électrode sélectif d’ions pour la silanisation et le remplissage de l’extrémité du baril sélectif d’ions avec un échangeur d’ions liquides ; WPI vend deux versions de ce support, M3301EH transparent et M3301EH noir. D’après notre expérience, le M3301EH clair semble être plus solide que le M3301EH noir.
Micromanipulateur	Narishige	MM-3	pour positionner la microélectrode sélective d’ions préfabriquée pendant la silanisation et le remplissage de l’extrémité du cylindre sélectif d’ions avec un échangeur d’ions liquide ; peut être remplacée par n’importe quel micromanipulateur à trois axes en bon état de fonctionnement
Objectif 5x sec	Olympe	MPlan N
Objectif 10x immersion dans l’eau	Olympe	UMPlan FL N	L’objectif 10x est l’immersion dans l’eau, l’ouverture numérique est de 0,3, la distance de travail est de 3,3 mm
Plate-forme et platine de translation X-Y pour microscope à platine fixe	EXFO	Gibraltar Burleigh	La plate-forme contient la chambre de coupe, les micromanipulateurs et les accessoires, la platine de translation X-Y déplace le microscope sans compromettre la stabilité de l’enregistrement
Micromanipulateur robotique avec positionnement précis X,Y,Z	Instruments Sutter	Réf. MP-285	Deux micromanipulateurs sont nécessaires pour tenir séparément la microélectrode sélective d’ions et la microélectrode iontophorétique. Il est également possible de coller des micropipettes dans un réseau espacé (voir texte).
unité de conditionnement de signal avec filtre passe-bas	Axon Instruments	CyberAmp 320 ou 380	n’est plus disponible auprès du fabricant mais peut être disponible auprès d’E-Bay ; alternatives : par exemple le filtre/amplificateur FLA-01 de Cygnus Technology. Il s’agit d’un instrument monocanal avec une coupure minimale à 10 Hz à l’aide d’un filtre de Bessel multipolaire, mais l’entreprise peut être disposée à le modifier pour une fréquence de coupure plus basse (2 Hz) si nécessaire.
fil d’argent	Systèmes A-M	Réf. 7830	diamètre 0,015", nu (sans revêtement)
chambre de tranche	Appareil de Harvard	Modèle Warner RC-27L	Il s’agit d’une chambre de tranche d’immersion, n’utilisez pas la chambre de tranche d’interface
Stéréomicroscope			pour la silanisation et le remplissage de l’extrémité du cylindre sélectif d’ions avec un échangeur d’ions liquides ; monté horizontalement ; divers fournisseurs
chlorure de tétraméthammonium (TMA)	Sigma-Aldrich	Réf. T-3411	solution 5 M ; ATTENTION : toxicité aiguë (orale, cutanée, inhalation), cancérogénicité, dangereux pour l’environnement aquatique, voir les informations de sécurité de Sigma-Aldrich pour une description complète