Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
C57BL/6 (H-2b) des souris femelles, âgées de 8 semaines, ont été achetées et des souris C57BL/6 AQP4-/- ont été fournies par A. Verkman.
1. Immunisation des souris avec des peptides AQP4
- Préparez le stock de travail complet de l'adjuvant de Freund (CFA).
- Broyer finement une préparation desséchée de Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) à l’aide d’un mortier et d’un pilon.
- Ajouter du H37Ra moulu à l'adjuvant de Freund incomplet jusqu'à une concentration finale de 4 mg/mL. Le CFA peut être conservé à 4 °C jusqu’à 6 mois.
- Dissoudre le peptide AQP4 de l’antigène lyophilisé (Ag) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) jusqu’à une concentration finale de 1 mg/mL. Maintenir à 4 °C ou sur glace.
- Préparer l’assemblage de 2 seringues luer-lock, reliées par un robinet d’arrêt, contenant l’émulsion CFA/peptide.
- Fixez une seringue Luer-Lock en verre sans piston à un robinet d’arrêt en nylon à 3 voies avec 2 raccords Luer-Lock mâles. Fermez le robinet d’arrêt en tournant le levier vers la seringue. Positionnez l’extrémité ouverte de la seringue vers le haut, permettant à la seringue d’agir comme un tube à essai. Placez-le dans un support tubulaire pour plus de stabilité.
- Vortex, le stock de travail CFA et la solution Ag. Ajouter un volume de 1:1 de peptide/CFA dans la seringue ouverte. 200 μL de CFA/Ag (4 x 50 μL) sont nécessaires par souris.
note: En règle générale, environ 1 mL de préparation est perdu dans le robinet d’arrêt, ce qui réduira la quantité disponible pour l’immunisation. Il est donc important de l’intégrer dans le calcul du volume total requis.
Exemple : Pour l’immunisation de 5 souris : (200 μL/animal x 5 animaux) + 1 mL de volume supplémentaire = 2 mL d’AGF/Ag total requis.
- Insérez le piston en verre dans la seringue et, tout en le maintenant en place, retournez la seringue de manière à ce que le robinet d’arrêt soit orienté vers le haut. Basculez le levier du robinet d’arrêt sur la connexion femelle inutilisée. Appliquez soigneusement une pression sur le piston en verre afin d’éliminer l’excès d’air de la seringue. Le liquide remplit le deuxième raccord Luer-lock mâle du robinet d’arrêt.
- Fixez une deuxième seringue en verre (piston complètement inséré) au deuxième raccord Luer-lock mâle du robinet d’arrêt. Il doit s’agir d’un système fermé de 2 seringues en verre reliées à un robinet d’arrêt contenant le moins d’air en excès possible.
- Pour créer une émulsion, mélangez en poussant les pistons pour faire passer le liquide en alternance entre les 2 seringues pendant environ 2 min. Refroidissez les seringues sur de la glace pendant environ 10 min. Répétez le refroidissement et le mélange jusqu’à ce qu’il y ait un changement net de viscosité de la préparation, ce qui donne une émulsion blanche très ferme. Réfrigérer les seringues contenant l’émulsion à 4 °C ou les maintenir sur de la glace.
- Transférez toute l’émulsion dans une seringue Luer-lock en verre, retirez la seringue en verre vide et remplacez-la par une seringue Luer-Lock de 1 mL pour injection. Remplissez la nouvelle seringue d’émulsion, retirez-la du robinet d’arrêt et fixez-y une aiguille (25G x 5/8).
- « Testez à l’eau » l’émulsion pour la consistance. Expulsez une goutte de l’émulsion dans un petit bol d’eau. L’émulsion ne doit pas se disperser, ce qui indique qu’elle convient à l’injection.
- Si l’émulsion se disperse, elle n’est pas prête à être injectée ; transférez le liquide dans les seringues en verre et continuez à mélanger, puis refroidissez à nouveau jusqu’à ce que l’émulsion soit ferme.
- Testez à nouveau l’émulsion jusqu’à ce que la consistance appropriée ait été atteinte.
- Injecter par voie sous-cutanée (s.c.) des souris AQP4-/- donneuses avec une émulsion contenant le peptide AQP4. Chaque souris reçoit 4 injections de 50 μL s.c. (200 μL au total (100 μg de peptide)). Les 4 sites comprennent les deux côtés de la partie inférieure de l’abdomen, qui se drainent dans les ganglions lymphatiques inguinaux (LN), et les deux côtés de la paroi thoracique médialement à chaque aisselle, qui se drainent dans la LN axillaire. Le transfert adoptif nécessitera 1 à 2 souris donneuses immunisées par souris receveuse.
2. Culture de lymphocytes T et polarisation pro-inflammatoire des lymphocytes T
- 10 à 12 jours après l’immunisation, prélever le LN sur les souris.
- Dans un bac à glaçons, préparer des boîtes de Pétri de 60 mm munies d’une crépine cellulaire (maille de 70 μm) et contenant un milieu réfrigéré du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) avec 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS) et 100 U/mL de pénicilline-100 μg/mL de streptomycine (pen-streptomycine) (RFPS).
- Euthanasier les souris par exposition au CO2, suivie d’une luxation cervicale. Immergez les souris dans de l’éthanol à 70 %, puis épinglez chaque coussinet plantaire sur une planche de dissection.
- Coupez une incision cutanée médiane de l’aine au cou et le long de chaque jambe. Retirez la peau du péritoine et épinglez-la fermement à la planche. Disséquer les LN inguinaux et axillaires et les placer dans la boîte de Pétri contenant le RFPS, sur de la glace.
- Pour les expériences de transfert adoptif, combinez les LN de tous les animaux du même groupe d’immunisation. Pour les analyses cytométriques en flux de l’utilisation de Vβ, séparer les LN des animaux individuels.
- Placez la crépine de cellule contenant le LN sur un tube à centrifuger de 50 mL contenant du RFPS. À l’aide de l’extrémité plate d’un piston de seringue stérile de 5 ml, pressez les cellules LN à travers la crépine, en les lavant avec 20 à 30 ml de RFPS pour faciliter la récupération des cellules. Maintenir les cellules LN sur de la glace tout au long du traitement jusqu’au moment de la culture.
- Laver deux fois, en centrifugeant à 393 x g pendant 5 min. Après le deuxième lavage, remettre en suspension les cellules LN dans un milieu à cellules T (TCM). La MTC contient de l’IPRP avec 10 % de FBS inactivé par la chaleur, 292 μg/mL de L-glutamine, 110 μg/mL de pyruvate de sodium et 55 μM de 2-mercaptoéthanol et de pen-streptocoque. En règle générale, un volume de 5 ml de TCM par souris donneuse est utilisé.
- Comptez les cellules LN. Le rendement attendu est d’environ 3-6 x 107 cellules LN par donneur de souris immunisé.
- Mettre en place des cultures polarisantes pour le transfert adoptif.
- Préparez une culture polarisante Th17 de 5 x 10cellules 6 LN par mL avec 10 μg/mL d’Ag, 20 ng/mL d’interleukine (IL)-23 de souris recombinante et 10 ng/mL d’IL-6 de souris recombinante dans la MTC.
- Alternativement, pour la polarisation Th1, préparer une culture de 5 x 106 cellules LN par mL avec 10 μg/mL d’Ag et 10 ng/mL d’IL-12 de souris recombinante dans la MTC.
- Ajouter 2 ml (1 x 107 cellules) par puits du mélange de culture polarisant dans une plaque à 12 puits. Les cellules LN de 2 à 4 souris donneuses rempliront une plaque de 12 puits. Maintenir les cultures dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 72 h.
- Vérifiez visuellement l’activation des cellules LN en culture à 48 h et 72 h. Les cellules activées formeront des grappes étendues et les cellules T augmenteront en taille, devenant plus pléomorphes. L’augmentation du métabolisme provoquera une baisse du pH dans le milieu, passant de la pêche à l’orange. Si le pH est suffisamment bas pour rendre le milieu jaune, ajoutez 1 mL de MTC fraîche pour éviter la toxicité pour les cellules dans les 24 heures restantes.
- Procéder au transfert adoptif.
3. Transfert adoptif de lymphocytes T pathogènes spécifiques à AQP4
REMARQUE : Cette étape découle de la Section 2.5 : Culture de cellules T et polarisation pro-inflammatoire des cellules T.
- Récupérez les cellules polarisées à partir de plaques à 12 puits en les pipetant de haut en bas pour les déloger et en les transférant dans un tube de 50 ml. Maintenir sur glace jusqu’aux injections.
- Comptez les cellules, lavez-les deux fois dans du PBS froid et préparez une suspension de 1 x 108 cellules/mL dans du PBS. Généralement, injectez des cellules dans l’heure.
- Mélangez doucement les cellules en les remuant et transférez-les dans une seringue de 1 mL au moment de l’injection. Administrer 200 μL de cellules (2 x 107) par voie intraveineuse (i.v.) à chaque souris, par la veine de la queue.
- Injectez à chaque souris receveuse i.p. 200 ng de toxine B. pertussis diluée dans 200 μL de PBS ce jour-là et 2 jours plus tard. Surveillez quotidiennement les souris pour détecter les signes de maladie clinique.
