Coloration immunofluorescente de populations neuronales dans le tractus gastro-intestinal embryonnaire murin

Résumé

Source : Barlow-Anacker, A. J., et al., Immunomarquage pour visualiser le développement du système nerveux entérique murin. J. Vis. Exp. (2015)

Cette vidéo démontre l’immunocoloration du tractus gastro-intestinal murin embryonnaire pour visualiser et analyser la distribution de la population neuronale à l’aide de l’immunofluorescence et de la microscopie confocale.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Protocole d’immunomarquage

1. Si les échantillons ont été stockés dans 30 % de saccharose, rincez-les 3 fois pendant 20 min dans 1x PBS sur une plate-forme à bascule.
2. Placez les voies gastro-intestinales dans la solution de blocage sur une plate-forme à bascule pendant 1h à RT.
3. Retirer la solution bloquante et incuber les voies gastro-intestinales avec la quantité appropriée d’anticorps primaires dilués dans la solution bloquante pendant 4 heures à RT ou O/N à 4 °C sur une plate-forme à bascule. Utilisez une dilution de 1:1 000 d’anticorps anti-Hu humain (sérum obtenu du patient), une dilution de 1:1 000 d’anticorps anti-protéine fluorescente verte (GFP) de poulet et une dilution de 1:100 d’anticorps anti-ChAT de chèvre.
   note: Nous utilisons un anticorps humain anti-Hu qui a été obtenu localement auprès d’un patient ; cependant, des anticorps anti-Hu sont disponibles dans le commerce, par exemple, des anticorps anti-Hu de souris (utilisation à une dilution de 1:500).
4. Rincez les voies gastro-intestinales en 1x PBS 3 fois pendant 5 min, puis pendant 1 heure à RT sur une plate-forme à bascule.
5. Remplacez le 1x PBS par des anticorps secondaires dilués à 1:500 dans une solution bloquante sur une plate-forme à bascule pendant 4 heures à RT ou O/N à 4 °C. Utilisez un colorant anti-amines humaines d’âne tel que Dylight, âne anti-poulet Cy2 et âne anti-chèvre Cy5. Si vous utilisez l’anticorps anti-Hu de souris, utilisez une dilution de 1:500 de colorant réactif aux amines anti-souris d’âne 405.
   note: L’intensité de l’expression endogène de la GFP et de la tdTomato et la clarté de l’immunomarquage augmentent avec l’âge du développement. Nous immunocolorons généralement les intestins embryonnaires individuellement dans des tubes de 0,2 ml avec 150 μl de solution de coloration afin de réduire le volume d’anticorps utilisé et d’assurer une coloration efficace des tissus.
6. Rincez les voies gastro-intestinales en 1x PBS 3 fois pendant 5 min, puis pendant 1 heure à RT sur une plate-forme à bascule.
7. Placez quelques gouttes de milieu de montage par fluorescence avec DAPI sur une lame de verre. Immergez le tractus gastro-intestinal dans le milieu de montage par fluorescence et ajoutez un verre de protection directement sur le tissu. Le milieu de montage par fluorescence -G est un composé soluble dans l’eau qui assure une étanchéité semi-permanente.
   note: Utilisez un milieu de montage par fluorescence tel que Vectashield, un milieu de montage à base de glycérol qui empêche la décoloration des anticorps et le photoblanchiment. Ces deux produits permettent de stocker les tissus pendant de longues périodes à 4 °C.
8. Capturez des images de chaque fluorophore à l’aide d’un microscope confocal. Utilisez les longueurs d’onde d’excitation pour les fluorophores et les filtres utilisés dans le tableau 1.
9. Effectuer l’analyse d’images assistée par ordinateur à l’aide d’un logiciel approprié selon le type de confocaux utilisé pour capturer les images.

Tableau 1 : Longueurs d’onde d’excitation d’imagerie confocale, fluorophores et filtres. Les longueurs d’onde d’excitation, les fluorophores détectables et les filtres utilisés sont présentés. Cette information peut être utilisée pour choisir des combinaisons d’anticorps secondaires pour l’immunofluorescence multicolore.

Excitation			Émission
Ligne laser	Type fluorophore	Exemples	Tube photomultiplicateur	Options de filtre
408 milles marins	bleu	Alexa Fluor 405, Cascade Blue, Coumarin 30, DAPI, Hoechst, Pacific Blue, la plupart des points quantiques	1	BP 425-475 nm
488 milles marins	vert	Alexa Fluor 488, ATTO 488, Calcein, Cy2, eGFP, FITC, Vert Oregon, YO-PRO-1	deux	BP 500-550 nm
561 milles marins	rouge	Alexa Fluor 546, 555, 568 et 594, Cy3, DiI, DsRed, mCherry, Phycoérythrine (PE), Propidium iodé (PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC	3	BP 570-620 nm
638 milles marins	Rouge lointain	Alexa Fluor 633 et 647, allophycocyanine (APC), Cy5, TO-PRO-3	4	BP 663-738 nm

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Saline tamponnée au phosphate	Oxoïde	BR0014G
Albumine sérique bovine	pêcheur	BP1605
Triton X-100	sigma	X100
Lunette de fluorescence	Nikon	Stéréoscope SMZ-18
Tubes Eppendorf de 1,5 ml	VWR	Référence 20170-038
Fluoromount-G	SouthernBiotech, Birmingham, Alabama	Référence 0100-01
Glissières en verre	pêcheur	Référence 12-550-15
Verre de protection	VWR	Référence 16004-330
Microscope confocal	Nikon	Nikon A1
Éléments Nikon	Nikon

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