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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Modèle animal
- Croisez des souris hémizygotes Tg(Gfap-luc+/-) (souris transgéniques exprimant la luciférase des lucioles) avec des souris hémizygotes Tg(M83+/-) hémizygotes (souris transgéniques exprimant l’alpha-synucléine humaine avec la mutation familiale A53T) pour générer des souris hémizygotes bigéniques Tg(M83+/- :Gfap-luc+/-) souris.
- Génotypez la descendance avec une réaction en chaîne par polyémérase (PCR) en temps réel pour la présence du transgène codant pour l’alpha-synucléine humaine et avec une PCR standard pour la luciférase de luciférase.
- Inoculez les animaux à l’âge de six à huit semaines.
2. Préparation de l’inoculum
- Préparer de l’alpha-synucléine humaine recombinante monomère avec la mutation A53T dans un tampon salin tamponné Tris (TBS) contenant 150 mM de NaCl dans 20 mM de Tris-HCl (pH 7,2).
- Préparez l’alpha-synucléine fibrillaire pour les inoculations en agitant 3 μg/μL d’alpha-synucléine humaine recombinante monomère dans un agitateur orbitaire à 800 tr/min et 37 °C pendant 5 jours.
- Diluer les assemblages de fibrilles dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour atteindre une concentration finale de 1 μg/μL pour les inoculations intrapéritonéales.
- Fragmentez les fibrilles d’alpha-synucléine à l’aide d’un sonicateur à bâtonnets pendant 1 min (40 impulsions d’une durée de 0,5 s avec une pause d’une seconde entre chaque impulsion et une amplitude réglée à 50 %) sur glace. Pour éviter la contamination par ensemencement croisé, utilisez des sondes de sonication propres pour préparer différents inoculum.
3. Injections intrapéritonéales
- Pour les injections intrapéritonéales, narcotiser brièvement les animaux dans une chambre d’anesthésie par inhalation avec de l’isoflurane/oxygène à l’aide d’un débit de 2 L/min et du vaporisateur réglé à 2 %. Pincez l'orteil de l'animal et confirmez qu'il ne retire pas son membre postérieur pour assurer une bonne anesthésie.
- Remplissez une seringue hypodermique jetable de 27 g avec 50 μL de fibrilles d’alpha-synucléine soniquées ou de PBS.
- Injecter directement dans le péritoine de la souris et éviter de pénétrer dans l’intestin grêle ou le caïcum situé derrière la paroi abdominale en tenant l’animal en position dorsale, la tête tournée vers l’arrière de l’investigateur et vers le bas à environ 45°. Surveiller les animaux jusqu’à ce qu’ils se soient remis de l’anesthésie.