1. Surveillance de la propagation transcellulaire de protéines de type prion par imagerie time-lapse in vivo
REMARQUE : Cultivez des lignées de C. elegans de type sauvage (WT) (N2) et transgéniques selon les méthodes standard et contrôlez soigneusement la température de culture.
- Générer des lignées transgéniques de C. elegans exprimant la protéine de type prion, marquée avec une protéine fluorescente rouge monomère (mRFP).
- Préparer des populations synchronisées par ponte ou blanchiment selon les méthodes standard.
- Synchronisation par ponte
- Transférez 10 à 20 adultes gravides sur une assiette et laissez-les pondre des œufs pendant 1 à 2 heures. Retirez les adultes de l’assiette et laissez la progéniture grandir jusqu’à l’âge désiré.
- Synchronisation par blanchiment
- Prélever une population non synchronisée d’adultes gravides et les blanchir avec une solution alcaline d’hypochlorite (250 mM d’hydroxyde de sodium (NaOH) et dilution 1:4 (v/v) d’eau de Javel commerciale dans l’eau (H2O)). Laver les œufs deux fois (218 x g pendant 1 min) avec le tampon M9 (21 mM Na2HPO4·7H2O (hydrogénophosphate disodique heptahydraté), 22 mM (dihydrogénophosphate de potassium) KH2PO4, 86 mM chlorure de sodium (NaCl), 1 mM MgSO4·7H2O (sulfate de magnésium heptahydraté), ajouter dH2O jusqu’à 1 L).
- Laissez-les éclore dans la zone tampon M9 en les agitant doucement pendant la nuit à 20 °C. Le développement des vers sera arrêté au stade L1 en l’absence d’une source de nourriture, laissant une population synchronisée. Transférez les L1 sur des plaques de milieu de croissance de nématodes (NGM) fraîches ensemencées avec la bactérie OP50 E. coli et laissez la descendance se développer jusqu’à l’âge désiré.
- Préparez des tampons d’agarose à 2 % (en H2O) sur une lame de microscope comme décrit.
- Préparez deux lames de microscope avec du ruban adhésif d’étiquetage placé sur toute leur longueur pour les utiliser comme entretoises. Placez une troisième lame de microscope entre elles.
- Dissoudre 2 % d’agarose dansH2O et pipeter une goutte sur la lame propre.
- Placez une quatrième lame perpendiculaire aux trois autres lames au-dessus de la goutte d’agar. Appuyez doucement dessus pour aplatir le tampon à la même épaisseur que le ruban d’étiquetage.
- Laissez sécher pendant 1 minute avant de retirer les entretoises et de séparer doucement les lames. Le tampon gélosé collera à l’un d’entre eux.
- Pipeter ~10 μl d’anesthésique (2 mM de lévamisole dans le tampon M9) sur le tampon et transférer ~10 animaux à l’aide d’un pic en fil de platine. Couvrir avec une lamelle (~22 x 22 mm) et prendre des images dans un délai de 1 heure.
- Alternativement, pour acquérir des films sur une plus longue période de temps ou pour réduire davantage la possibilité de tout mouvement des animaux, utilisez une combinaison d’anesthésique et d’immobilisation des billes.
- Préparez des tampons d’agarose à 10 % (dans le tampon M9) comme décrit et ajoutez des vers à une solution d’étalons de taille nanosphérique de 3 μl (billes de polystyrène, 100 nm) plus 3 μl d’anesthésique (4 mM de lévamisole dans le tampon M9). Couvrez délicatement avec une lamelle. Pour éviter la dessiccation, scellez la lamelle avec du VALAP (un mélange de quantités égales de vaseline, de lanoline et de cire de paraffine).
- Imagez des vers immobilisés à l’aide d’un microscope confocal.
REMARQUE : Les résultats sont obtenus à l’aide d’un microscope confocal AF à disque rotatif équipé d’une caméra EM-CCD et d’un logiciel d’automatisation de la microscopie et d’analyse d’images tel que MetaMorph décrit les spécificités ci-dessous, mais d’autres systèmes d’imagerie confocale comparables peuvent également être utilisés.
- Utilisez l’objectif à huile 63X ou 100X/1.4NA et placez la lame de microscope contenant les vers dans le porte-lame de microscope.
- Ouvrez le logiciel. Ajustez la puissance et les filtres laser pour l’imagerie mRFP. Utilisez le laser 561 nm à 10 % de puissance et le filtre d’émission >600 nm.
- Ouvrez « MultiDimensional Acquisition ». Sous l’onglet « Principal », cochez les cases « Timelapse » et « Exécuter les journaux » (mise au point automatique matérielle : désactivée).
- Sous l’onglet « Sauvegarde », sélectionnez ou créez le dossier de répertoire où les fichiers doivent être enregistrés. Attribuez un nom au fichier.
- Sous l’onglet « Longueur d’onde », sélectionnez l’éclairage approprié et ajustez l’exposition et le gain. Utilisez « YokoQuad Red » (ou un réglage d’éclairage équivalent pour l’imagerie mRFP) avec une exposition comprise entre 100 et 300 ms et un gain de caméra compris entre 100 et 300, en fonction de l’échantillon individuel (évalué à l’aide de l’image en direct).
- Sous l’onglet « Timelapse », sélectionnez « Nombre de points de temps » = 301, « Durée » = 5 min et « Temps/Intervalle » = 1 sec.
- Sous l’onglet « Journaux », sélectionnez Journal : « AFC SET Z HOLD » et « AFC Return to Z HOLD », Type : « Spécial » (deux fois), Point initial : « Début du point de temps » et « Fin du point de temps ». Cette option de mise au point automatique est importante pour imager la même section sur une plus longue période de temps.
- Une fois la configuration terminée, appuyez sur « Acquérir ». La vidéo timelapse est enregistrée sous forme de fichiers TIFF distincts.
