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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Production et purification du virus adéno-associé recombinant (rAAV)
Remarque : la production et la purification du vecteur rAAV ont été effectuées par le Leuven Viral Vector Core (LVVC).
- Brièvement, transfectez des cellules HEK 293T adhérentes subconfluentes à passage faible (<50) à l’aide d’une solution de transfection linéaire de polyéthylénimine 150 nM NaCl de 25 kD et de trois plasmides différents dans un rapport de 1:1:1 dans du sérum bovin fœtal DMEM moyen à 2 %. Après 24 heures d’incubation à 37 °C dans un sérum de veau fœtal à 5 % de CO2, remplacer le milieu par du milieu DMEM frais à 2 % de sérum fœtal bovin.
note: Les plasmides comprennent les constructions du sérotype AAV7, du plasmide de transfert AAV codant pour l’alpha-synucléine humaine mutante A53T (α-SYN) sous le contrôle du promoteur amélioré de la synapsine1 CMVie, et du plasmide adénoviral auxiliaire pAdvDeltaF6.
- Récoltez le milieu 5 jours après la transfection transitoire et concentrez-le par filtration à flux tangentiel.
- Purifier les particules vectorielles rAAV du milieu concentré à l’aide d’un gradient d’étape d’iodixanol.
- Utilisez des techniques standard de PCR en temps réel pour la détermination de la copie génomique (GC). Dans ce protocole, un titre de vecteur de 3,0 E11 GC/ml a été utilisé pour développer un modèle de rat basé sur α-SYN pour la maladie de Parkinson (MP).
2. Injection stéréotaxique du vecteur rAAV α-SYN dans la substance noire (SN) du rat (Figure 1)
- Abriter des rats Wistar femelles de huit semaines pesant environ 200 à 250 g dans un cycle normal de 12 heures entre la lumière et l’obscurité, avec un accès libre à de la nourriture en granulés et à l’eau du robinet.
- Soumettre le rat à une anesthésie intrapéritonéale (i.p.) contenant un mélange de kétamine (60 mg/kg) et de médétomidine (0,4 mg/kg). Une fois que le rat est anesthésié et ne réagit pas lorsqu'il serre les différentes pattes, administrez un micro-transpondeur par voie sous-cutanée sur le dos du rat pour une reconnaissance ultérieure à l'aide d'un implanteur de micro-transpondeur. Vérifiez si le micro-transpondeur est correctement positionné et peut être lu par l’appareil de lecture.
- Coupez les cheveux sur le dessus du cuir chevelu. Appliquez un anesthésique local sur le cuir chevelu et les oreilles. Effectuer le reste de l’intervention chirurgicale sous un flux laminaire en utilisant des techniques aseptiques.
- Placez les rats dans un cadre stéréotaxique à l’aide de deux barres d’oreille, d’une bouche et d’une barre nasale. Couvrez le corps du rat avec une couverture en papier pour éviter une baisse de la température corporelle. Appliquez un lubrifiant oculaire pour éviter que les yeux ne se dessèchent.
- Désinfectez le cuir chevelu avec du jodium 1 % dans de l’isopropanol 70 % et faites une petite incision sur la ligne médiane du cuir chevelu. Grattez doucement les membranes du crâne et rincez avec une solution saline. Laissez sécher le crâne pendant plusieurs minutes. Observez les sutures crâniennes et les deux points de référence : Bregma et Lambda.
- Pour injecter le vecteur rAAV dans le SN, il faut définir les coordonnées vers Bregma (antéropostérieure : 5,3 mm ; médiolatérale : 2,0 mm ; et dorso-ventrale : 7,2 mm calculée à partir de la dure-mère).
note: Les coordonnées tridimensionnelles de chaque région d’intérêt peuvent être calculées à l’aide d’un atlas stéréotaxique du cerveau du rat, en appliquant Bregma comme point de référence anatomique.
- Remplissez une seringue de micro-injection de 10 μl (calibre 30 20 mm) avec le vecteur rAAV et placez-la dans l’instrument stéréotaxique relié à une pompe de micro-injection motorisée. Contrôlez le volume en libérant une goutte de vecteur et éliminez dans un détergent de nettoyage polyvalent le pH 9 (par exemple RBS).
- Vérifiez visuellement si la tête est fixée droite dans le cadre de la tête et évaluez l’axe gauche-droite. Définissez visuellement avec soin les coordonnées antéropostérieures et médiolatérales de Bregma et Lambda et mesurez leur hauteur à l’aide d’une aiguille de calibre 30 de 20 mm dans le bras dorso-ventral du cadre stéréotaxique.
- Permettre une différence de hauteur maximale de 0,3 mm entre Bregma et Lambda. Replacez l’aiguille sur Bregma et appliquez les coordonnées antéropostérieure et médiolatérale en déplaçant l’antéropostérieur et le bras médiolatéral du cadre stéréotaxique.
- Au lieu d’injection, mesurez la hauteur du crâne et assurez-vous qu’elle ne diffère pas de plus de 0,3 mm de la hauteur de Bregma. Percez un trou dans le crâne d’un diamètre d’environ 2 mm. Mesurez la hauteur de la dure-mère, qui servira de référence pour l’application de la coordonnée dorso-ventrale. Vous pouvez également soustraire une épaisseur fixe pour le crâne (0,9 mm).
- Pénétrez la dure-mère à l’aide d’une aiguille de calibre 26 et absorbez le sang avec du tissu stérile. Attendez que tout saignement ait cessé avant de continuer.
- Insérez lentement la seringue de micro-injection de 10 μl préchargée avec la solution vectorielle dans le cerveau jusqu’à la profondeur prédéterminée (coordonnée dorso-ventrale). Attendez 1 min avec l’aiguille en place. Injecter 3 μl de solution vectorielle (3,0 copies du génome E11/ml (dose moyenne du vecteur) ou 1,0 E12 GC/ml (dose élevée du vecteur) du vecteur témoin rAAV2/7 α-SYN ou eGFP) à l’aide de la pompe de micro-injection motorisée avec un débit de 0,25 μl/min.
- Après l’injection, maintenez l’aiguille en place pendant encore 5 minutes avant de la retirer lentement. Coudre le cuir chevelu à l’aide de polyester tressé 3.0 enduit, désinfecter avec 1 % de jodium dans 70 % d’isopropanol et retirer délicatement l’animal de l’instrument stéréotaxique. Desserrez d’abord la barre du nez et de la bouche, puis les deux barres d’oreille.
- Pour inverser l’anesthésie, injectez au rat par voie intrapéritonéale 0,5 mg/kg d’atipamézole et placez le rat dans une cage propre sur une plaque chauffante à 38 °C jusqu’à ce qu’il se réveille. Couvrez le rat avec une couverture en papier pour éviter une baisse de la température corporelle.
- Fournir un accès facile à la nourriture et à l’eau pendant les premières heures. Surveillez le rat pendant les premiers jours. Si nécessaire, appliquez analgesia.
note: Il n’est pas nécessaire de retirer les points de suture du crâne. Après 1 à 2 semaines, le crâne est complètement réparé et les points de suture se détachent.
