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Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Homogénéisation et fractionnement
- Sélection des tissus
REMARQUE : Des tissus du cortex frontal post-mortem congelés provenant de témoins sains (Ctl) et de cas de MA pathologiquement confirmés ont été sélectionnés (n = 2). L'évaluation neuropathologique post-mortem de la distribution de la plaque amyloïde a été réalisée selon les critères de notation semi-quantitatifs du Consortium pour l'établissement d'un registre de la maladie d'Alzheimer, bien que la pathologie de l'enchevêtrement neurofibrillaire ait été évaluée conformément au système de stadification Braak.
- Prélever du tissu cérébral post-mortem congelé à partir de témoins sains (Ctl) et de cas de MA confirmés pathologiquement. À l’aide de récipients de glace sèche, de pinces et d’une lame de rasoir, excisez des portions de ~ 250 mg de matière grise de chaque échantillon de tissu sur des bateaux de pesée jetables tarés, en prenant soin d’empêcher le tissu de dégeler. Enregistrer le poids de chaque pièce à homogénéiser.
- Exciser ~ 250 mg de matière grise à l’aide d’une pince et d’un rasoir en inspectant visuellement pour localiser l’interface entre la matière grise externe et la substance blanche intérieure. Évitez la matière blanche et, plus important encore, les gros vaisseaux sanguins ou les régions sanglantes, les méninges ou la matière arachnoïdienne. Gardez le tissu congelé pendant le processus de coupe en travaillant rapidement et fréquemment en plaçant le bateau de pesée avec du tissu cérébral dans des récipients en polystyrène avec de la glace sèche.
- Enregistrez le poids exact de matière grise excisée de chaque morceau congelé à l’aide d’une balance analytique. Calculer le volume de tampon à faible teneur en sel (LS) (voir le tableau 1) nécessaire à l’homogénéisation des dés (5 mL/g ou 20 % p/v).
- Préparez 10 ml de tampon LS avec 1 cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase et réfrigérez sur de la glace.
- Retirez le tissu pesé et le bateau de pesée de la glace sèche et coupez-le en morceaux d’environ 2 x 2 mm au fur et à mesure de la décongélation. Transférer dans un tube homogénéisateur de 2 ml pré-réfrigéré sur de la glace.
- Ajouter 5 mL/g (20 % p/v) de tampon glacé à faible teneur en sel (LS) avec un cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase.
- Homogénéiser le tissu cérébral sur la glace à l’aide d’environ 10 coups de pilon A à dégagement élevé et 15 coups de pilon B à faible dégagement.
- Transférez tout l’homogénat dans un tube en polypropylène de 2 mL à l’aide d’une pipette Pasteur en verre. Étiquetez le tube avec « TH » (Homogénate total), le numéro de la caisse de tissu et le volume de l’homogénat. Aliquote 0,8 mL dans un tube étiqueté de 1,5 mL. Tout excès d’homogénat peut être aliquote de la même manière et stocké à -80 °C.
- À chaque aliquote de 0,8 mL, ajouter 100 μL de NaCl 5 M et 10 % (p/v) de sarkosyl à des concentrations de 0,5 M et 1 % p/v, respectivement. Bien mélanger les tubes par inversion et incuber sur glace pendant 15 min. Étiquetez les tubes avec « TH-S » (Total Homogenate-Sarkosyl) pour indiquer que les homogénats sont dans un tampon sarkosyl (Tableau 1).
- Sonicez chaque tube pendant trois impulsions de 5 s à 30 % d’amplitude sur de la glace (intensité maximale = 40 %) à l’aide d’une sonde à micropointes.
- Déterminer les concentrations en protéines des homogénats à l’aide de la méthode de dosage de l’acide bicinchoninique (BCA).
note: La concentration moyenne en protéines des homogénats de TH-S préparés à 5 mL LS par gramme de tissu est de 15 à 20 mg/mL. Les homogénats peuvent être fractionnés immédiatement ou stockés à -80 °C jusqu’à utilisation.
- Diluer les homogénats de TH-S à 10 mg/mL à l’aide d’un tampon de sark glacé (tableau 1) avec 1x inhibiteurs de protéase et de phosphatase.
- Transvaser 5 mg de protéines (0,5 mL) de chaque homogénat TH-S dans des tubes à ultracentrifuger en polycarbonate de 500 μL et apparier la balance avec le tampon de serc. Chargez les tubes dans un rotor pré-refroidi et une ultracentrifugeuse à 180 000 x g pendant 30 min à 4 °C. Transférez les surnageants solubles dans les sarkosyles (S1) dans des tubes de 1,5 mL et stockez-les à -80 °C
REMARQUE : (Lavage en option) Ajoutez 200 μL de tampon à sark dans les tubes d’ultracentrifugation contenant les fractions insolubles au détergent (P1) et délogez les granulés (P1) du fond des tubes d’ultracentrifugation à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL.
- Essorez brièvement les tubes inversés pendant 2 à 3 s (≤2 500 x g) sur une microcentrifugeuse pour transférer les pastilles (P1) et le tampon dans les tubes de 1,5 mL situés en dessous. Remettez en suspension les granulés insolubles (P1) dans le tampon de sercs en pipetant de haut en bas pour vous assurer que le granulé est perturbé.
- Balance par paires et centrifugeuse à 180 000 x g pendant 30 min supplémentaires à 4 °C.
- Jeter le surnageant de lavage facultatif (S2) et incuber les pastilles insolubles au sarkosyle (P2) dans 50 à 75 μL de tampon d’urée (Tableau 1) avec 1x PIC (cocktail d’inhibiteurs de protéase et de phosphatase) pendant 30 min à température ambiante pour solubiliser la pastille.
note: Réchauffez le tampon d’urée à température ambiante avant utilisation pour éviter les précipitations SDS. Pour les applications sensibles aux détergents, omettez les FDS du tampon d’urée et envisagez de laver la pastille insoluble (P2) dans un tampon à faible teneur en sel avant de la remettre en suspension dans le tampon d’urée.
- Transférez les pastilles remises en suspension (P2) dans des tubes de 0,5 mL et utilisez une sonication brève (1 s) à micropointe à une amplitude de 20 % (intensité maximale = 40 %) pour solubiliser complètement les pastilles.
- Déterminer les concentrations protéiques des fractions sarkosyl-solubles (S1) et insolubles (P2) à l’aide de la méthode de dosage des BCA. Utilisez ces fractions immédiatement ou conservez-les à -80 °C jusqu’à utilisation.
Table 1 : Liste des tampons
| Solution de sarkosyle à 10 % p/v : 10 g de sel sodique N-lauryl-sarcosine pour 100 ml de ddH2O (agiter à RT pendant la nuit) |
| Tampon à faible teneur en sel (LS) : 50 mM HEPES pH 7,0, 250 mM de saccharose, 1 mM d’EDTA |
| Tampon Sarkosyl (sark) : Tampon LS + 1 % (p/v) de sarkosyl + 0,5 M de NaCl |
| Tampon d’urée (à conserver à -20 °C) : 50 mM Tris-HCl pH 8,5, 8M urée, 2 % SDS |