Évaluation de la fonction motrice dans un modèle expérimental de neurite auto-immune chez la souris

Abstract

Source : Gonsalvez, D. G., et al., A Simple Approach to Induce Experimental Autoimmune Neuritis in C57BL/6 Mice for Functional and Neuropathological Assessments. J. Vis. Exp. (2017).

Cette vidéo illustre le processus d’évaluation de la dysfonction motrice dans un modèle murin par l’administration de toxine coqueluche et d’un inoculum contenant des peptides et des adjuvants imitant la myéline, suivie de tests sur tapis roulant pour évaluer la fonction motrice et évaluer les lésions nerveuses résultantes dues à l’activation immunitaire et à la démyélinisation.

Protocol

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Induction EAN (Névrite Auto-immune Expérimentale)

REMARQUE : L’EAN peut être induit avec succès chez les souris mâles C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines. Le protocole d’induction dure 9 jours au total. Le jour 0 correspond au jour de la première vaccination. Pour ce protocole, les injections ont été effectuées sous anesthésie (voir étape 1.1.2 ci-dessous).

1. Le jour -1 :
   1. Préparez la solution de toxine coqueluche (voir le tableau des matières) de 1,6 μg/mL à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate isotonique isotonique de souris (MT-PBS).
   2. Anesthésie à l’isoflurane :
      1. Placez la souris (C57BL/6, mâle, 6-8 semaines) dans la chambre d’anesthésie et ajustez le débit d’oxygène à 1 L/min.
      2. Allumez le vaporisateur d’isoflurane, réglez-le à 2,5 % pour l’anesthésie, surveillez la respiration et attendez 2 minutes ou jusqu’à ce que les réflexes primaires (cornée et membre postérieur) ne répondent plus.
   3. Retirer la souris de la chambre d’anesthésie et administrer 250 μL de la solution de toxine coquelucheuse ci-dessus par injection intrapéritonéale (i.p.) à l’aide d’une seringue de 0,5 mL avec une aiguille de 30_1/2 G.
   4. Préparez l’inoculum injectable pour l’immunisation :
      1. Préparez la solution A en utilisant une solution à 2 mg/mL de peptide P0180-199 (avec une pureté de > 98 %, séquence S-S-K-R-G-R- Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) dans une solution saline à 0,9 %.
      2. Préparer la solution B à l'aide d'une solution à 20 mg/mL de Mycobacterium tuberculosis (voir le tableau des matières) dans l'adjuvant complet de Freund (FCA, comprenant 15 % de monoolate de mannide + 85 % d'huile de paraffine et 0,5 mg/mL de Mycobacterium butyricum desséché, tué et séché).
      3. Pour obtenir l’inoculum final à injecter, mélangez des parties de volume égal des solutions A et B dans un batteur à billes et mélangez-les à vitesse maximale pendant 1 min à température ambiante.
         note: Les solutions A et B peuvent être conservées en stock et stockées à 4 °C pendant un mois au maximum, mais l’inoculum final combiné doit être fraîchement préparé le jour de l’injection chez la souris.
2. Le jour 0, administrer 50 μL de l’inoculum (préparation décrite à l’étape 1.1.4) à une souris par injection sous-cutanée à l’aide d’une aiguille de 23 G.
   note: L’injection peut être placée entre les omoplates ou entre le membre postérieur et la queue sur le dos caudal.
3. Le jour 1, préparez la solution de toxine coqueluche de 1,2 μg/mL (dans le MT-PBS) et administrez 250 μL à une souris par injection intraveineuse à l’aide d’une seringue de 0,5 mL avec une aiguille de 301/2 G.
4. Le jour 3, répétez l’étape 1.3 ci-dessus.
   note: Les solutions mères A et B peuvent être préparées et conservées à 4 °C pendant un mois au maximum. Cependant, l’inoculum injectable final, produit en combinant les solutions mères A et B, doit être effectué le jour de l’injection.
5. Le jour 8, administrer 50 μL de l’inoculum (préparation décrite à l’étape 1.1.4) à une souris par injection sous-cutanée (voir l’étape 1.2 ci-dessus) au même site d’injection qu’à l’étape 1.2 (pour chaque animal)

2. Évaluation de la fonction motrice

REMARQUE : La performance motrice est évaluée en parallèle avec la notation clinique pour la même cohorte d’animaux. L’appareil d’évaluation de la fonction motrice doit être connecté à un ordinateur doté d’un système d’imagerie de la fonction de marche (voir le tableau des matériaux). Il est également recommandé que toutes les souris à évaluer soient habituées à la tâche de course avant l’induction de l’EAN. Pour ce faire, des exercices (2 tests par souris) sont effectués trois jours avant l’induction de la maladie (jour -3).

1. Allumez l’appareil d’évaluation de la fonction motrice et allumez le bouton d’éclairage.
2. Ébouriffez fermement la souris et encrez ses pieds en la abaissant sur un récipient rempli d’encre rouge tout en tenant sa queue.
   note: Cette étape est requise pour la souche C57BL/6, mais peut être ignorée si une souche de souris avec une couleur de peau blanche est utilisée.
3. Placez la souris dans le compartiment de marche et réglez la vitesse du tapis de course sur 15 cm/s.
4. Allumez le tapis roulant et cliquez sur le bouton « enregistrer » pour capturer le mouvement de course de la souris à l'aide du système d'imagerie de la fonction de marche (voir le tableau des matériaux).
5. Utilisez une minuterie et mesurez chaque course pendant 36 s. Après 36 s, arrêtez l’enregistrement et arrêtez le tapis de course.
   note: Les souris qui ne peuvent pas terminer la tâche en cours d’exécution pendant cet intervalle de 36 s sont considérées comme ayant échoué.
6. Enregistrez le fichier vidéo dans le dossier désigné.
7. Répétez les étapes ci-dessus pour chaque souris à évaluer. Testez les souris avec la même tâche en cours d’exécution tous les 3 jours.
8. Analysez les fichiers vidéo édités à l’aide d’un logiciel pour les paramètres de la fonction de marche (voir la table des matériaux).
   note: Les détails de l'analyse des différents paramètres du moteur varient d'un logiciel à l'autre, veuillez donc vous référer aux instructions du fabricant avant l'analyse. Selon les objectifs spécifiques de la recherche, des tissus animaux peuvent être prélevés à n’importe quelle étape de l’évaluation post-motrices afin d’obtenir des preuves histologiques de lésions axonales et de myéline par immunohistochimie ou microscopie électronique.

Results

Tableau 1 : Paradigme du score clinique EAN.

score	critères	Notes et commentaires sur les critères d’évaluation
0	Souris normale
1	Moins vif OU mousseux	Ceci est évalué en r...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, mâle, 6-8 semaines	Australian Bioresources Cenre, WA, Australie
Toxine coqueluche	List Biological Laboratories, Inc., CA, États-Unis	#181
0,1 M de souris isotonique phosphaté tamponné salin (MT-PBS)			Les laboratoires auront leur propre protocole.
L’isoflurane	Pharmachem, QLD, Australie		Les laboratoires auront leur propre protocole d’administration.
Peptide P0180–199	Wuxi Nordisk Biotech Co. Lieutenant SHG, CHN		P0180–199, séquence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Mycobacterium tuberculosis tué par la chaleur (souche H37RA)	Difco, MI, États-Unis	#231141
Adjuvant complet de Freund (FCA)	Difco, MI, États-Unis	Réf. 263910
16 % de paraformaldéhyde (PFA)	Services de microscopie électronique	Réf. 15710	Diluer à 4 % de PFA le jour du prélèvement des tissus.
25 % de glutaraldheyde	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australie	#11-30-8	Diluer à 2,5 % de glutaraldéhyde le jour de la fixation.
Azoture de sodium	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australie	SL189	Création d’un stock de 10 % (p/v) dans des PB-MT de 0,1 M. Utiliser à 0,03 % (v/v).
saccharose	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australie	SA030	Utiliser à 30 % (p/v).
Température de coupe optimale (OCT) fluide	Sakura Finetek, Californie, États-Unis	Réf. 4583
Sérum d’âne normal	Merck Millipore, MA, États-Unis	#S30-100	Utilisation comme diluant d’anticorps à 10 % (v/v) ou à une autre concentration déterminée par son propre laboratoire.
Triton-X 100	Sigma Aldrich, MI, États-Unis	#90o2-31-1	Utilisation dans un diluant d’anticorps à 0,3 % (v/v) ou à une autre concentration déterminée par son propre laboratoire.
Protéine précurseur anti-amyloïde de lapin (APP)	Invitrogen (Life Technologies), Californie, États-Unis	S12700	Utilisé à 1:400 ou titré dans son propre laboratoire.
Protéine 1 associée à l’anti-contactine du lapin (Caspr)	Don du Prof Elior Peles, Institut Wiezmann des Sciences, Israël		Utilisé à 1:500 ou titré dans son propre laboratoire.
Anticorps secondaires conjugués à Alexa Fluor appropriés	Sondes moléculaires (Life Technologies), OR, États-Unis	divers	Utiliser à 1:200 ou titrer dans son propre laboratoire. Le choix de l’espèce dans laquelle l’anticorps a été élevé et d’Alexa Fluor choisi est à la discrétion de chaque laboratoire.
Solution de montage aqueux	Dako (Agilent), CA, États-Unis	#S3023	Chaque laboratoire aura sa propre préférence.
équipement
Seringue de 0,5 mL avec aiguilles de 30 g	Bd	#326105
Aiguilles de 23 g	Bd	#305143
Tampon encreur rouge			N'importe quel tampon encreur rouge ou colorant alimentaire rouge pourrait être utilisé pour marquer les pattes des animaux.
Appareil DigiGate (tapis de course inclus)	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Système d’imagerie DigiGate	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
chronomètre			N’importe quelle minuterie peut être utilisée.
Logiciel DigiGait 8	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Microscope de dissection	Zeiss		Tout microscope de dissection approprié peut être utilisé.
Toboggans chargés	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
Cyrostat	Leica		Tout cyrostat approprié peut être utilisé.
Équipement de perfusion et instruments de dissection			Les laboratoires auront leurs propres protoctols de perfusion.
Chambre humifiée opaque			Les laboratoires peuvent produire leurs propres produits à l’aide d’un récipient en plastique opaque.
PAP penne	GeneTex (États-Unis)		Un crayon de cire ou une tension superficielle peut également être utilisé pour créer un puits autour de la section du tissu.
Microscope confocal	Zeis LSM780		Tout microscope confocal avec des lignes laser appropriées peut être utilisé.
FIDJI/Image J	Instituts nationaux de santé		Disponible à partir de www.fiji.sc