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1. Couplage de l’expression du transgène Htt médiée par Gal4 et QF chez la drosophile
- Collecter et/ou générer des lignées transgéniques de Drosophila melanogaster contenant des « pilotes » Gal4 ou QF spécifiques aux tissus, ainsi que des lignées contenant des transgènes Htt de type sauvage ou mutants en aval de Gal4-UAS ou QF-QUAS. S’assurer que les protéines exprimées à partir de ces transgènes sont fusionnées à des protéines fluorescentes ou marquées à un épitope pour permettre la différenciation des produits transgéniques Htt mutants et de type sauvage chez la même mouche. Voir la figure 1.
REMARQUE : Nous utilisons généralement des fragments de l’exon 1 du gène Htt humain. Cependant, les mouches transgéniques peuvent plutôt être générées pour exprimer des fragments Htt plus longs ou d’autres gènes si vous le souhaitez.
- Planifiez la stratégie génétique de manière à ce que les transgènes Htt mutants et de type sauvage soient exprimés dans des populations cellulaires distinctes et non chevauchantes.
- En cas de chevauchement d’expression, les protéines Htt mutantes et de type sauvage synthétisées dans les mêmes cellules se co-agrègeront et empêcheront la détection d’événements de type prion. Pour éviter cela, utilisez les répresseurs spécifiques Gal4 et QF, Gal80 et QS40, respectivement (Figure 1). La sélection de moteurs Gal4 et/ou QF contrôlés par le développement peut aider à restreindre l’expression de Htt mutants aux cellules post-mitotiques, éliminant ainsi la possibilité que la division cellulaire puisse contribuer à la propagation des agrégats de cellule à cellule.
- En utilisant des conditions d’élevage standard, accouplez les mouches pour générer une descendance qui exprime Htt mutant via QF (ou Gal4) dans une population de cellules « donneuses » et Htt de type sauvage via Gal4 (ou QF) dans une population de cellules « receveuses ». Voir la figure 1 pour un schéma montrant une combinaison génétique possible.
note: Les pilotes QF et Gal4 qui ont été utilisés pour générer les données présentées dans les figures 1 à 4 et dans notre publication précédente comprennent le pilote de neurone récepteur olfactif (ORN) DA1, Or67d-QF, et le pilote panglial, repo-Gal4.
- Générer en parallèle des mouches témoins qui expriment des Htt de type sauvage dans des populations cellulaires marquées QF et Gal4.
- Prélever la progéniture du génotype désiré et dater les animaux au besoin.
2. Micro-dissection et fixation du cerveau de la drosophile adulte
REMARQUE : Cette procédure de dissection a été modifiée par rapport à une publication précédente et peut être utilisée pour préparer les cerveaux à l’imagerie de signaux de fluorescence directe à partir de fusions de protéines Htt-fluorescentes.
- Prélever les matériaux suivants et les placer sur de la glace : une solution saline tamponnée au phosphate contenant 0,03 % de Triton X-100 (PBS/T) ; des tubes de microcentrifugation contenant 970 μL de solution fixative de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % préparée en ajoutant 200 μL de PFA à 20 % de PFA à 770 μL DE PBS/T ; une boîte en verre transparent contenant un puits ; une pipette de transfert jetable ; deux pinces à dissection (une n° 3 et une n° 5).
- Anesthésiez les mouches adultes à l’aide de CO2 et transférez-les dans un puits du plat en verre sur de la glace.
- À l’aide d’une pipette de transfert, ajoutez une petite quantité (~ 500 μL) de PBS/T froid dans le puits contenant les mouches et dans un puits vide. Évitez d’introduire trop de bulles, car elles peuvent interférer avec la dissection.
- Placez la parabole en verre sur une surface plane sous un microscope à dissection et ajustez le grossissement jusqu’à ce que le corps de la mouche remplisse le champ de vision et soit net.
- Positionnez une paire de sources lumineuses en col de cygne de manière à ce que la lumière éclaire les deux côtés de la parabole en verre. Ancrez un mouchoir de laboratoire plié sous la boîte en verre pour jeter les parties du corps/cuticules pendant la dissection.
- À l’aide de la pince n° 3 dans la main non dominante, transférez une seule mouche dans le puits contenant PBS/T. Immobilisez la mouche en saisissant son abdomen avec la face ventrale vers le haut.
- En gardant la mouche complètement immergée dans PBS/T, retirez la tête de la mouche avec la pince n° 5 dans la main dominante. Insérez une pointe de ces pinces sous la cuticule dans le petit espace adjacent à la trompe d’un côté de la tête de mouche. Fixez la prise sur la tête en pinçant la pince pour saisir l’œil des deux côtés.
- Retirez la tête de la mouche de son corps en écartant les deux pinces. Jetez le corps de la mouche sur un mouchoir de laboratoire placé à proximité. Maintenez la pression sur la pince à main dominante afin de ne pas perdre la tête de la mouche.
- Placez l’une des pointes de la pince n° 3 dans la main non dominante dans le même petit espace sous la cuticule de l’autre côté de la trompe. Une fois positionné, pincez la pince pour saisir les yeux au même endroit des deux côtés de la tête.
- Une fois que la prise sur la cuticule est sécurisée, écartez doucement la pince à 180°. Cette action brisera la cuticule de la tête sans endommager le cerveau. Jeter le résidu de cuticule sur un tissu de laboratoire.
- Bien qu’idéale, la cuticule de la tête peut ne pas être complètement éliminée en une seule étape. Dans ce cas, retirez la cuticule morceau par morceau jusqu’à ce que le cerveau soit complètement exposé. Veillez à ne pas endommager le cerveau en évitant le contact direct avec les forceps.
- Retirez le cerveau disséqué du PBS/T soit en saisissant une trachée attachée, soit en aspirant le cerveau dans l’espace entre les pointes des pinces par capillarité.
note: L’ablation de la trachée est facultative, car elle a tendance à ne pas masquer les lobes antennaires sur la surface antérieure du cerveau où nous imaginons généralement. Cependant, si la trachée interfère avec l’imagerie, retirez-la soigneusement afin que le cerveau ne soit pas endommagé par cette manipulation.
- Transférez le cerveau de la mouche dans l’un des tubes de microcentrifugation contenant une solution fixatrice sur de la glace. Assurez-vous que le cerveau se détache de la pince et est immergé dans la solution fixatrice.
- Une fois que tous les cerveaux ont été disséqués, soumettez-les à une « solution courte » en plaçant les tubes fermés sur un nutator pendant ~ 5 min à température ambiante dans l’obscurité.
REMARQUE : Cette courte étape de fixation garantit que les cerveaux sont plus faciles à manipuler lors des étapes suivantes et n’adhèrent pas aux côtés du tube de microcentrifugation.
- Retirez la majorité de la solution fixatrice à l’aide d’une pipette P1000 et jetez-la.
- Évitez d’aspirer les cerveaux du tube pendant cette étape de lavage et toute étape de lavage ultérieure. Réglez le P1000 sur un volume inférieur (par exemple, 650 μL) et retirez le surnageant en deux étapes. De plus, tenez les tubes de la microcentrifugeuse alignés avec une source lumineuse (par exemple, des plafonniers) tout en aspirant pour mieux visualiser les cerveaux.
- Ajoutez 1 ml de PBS/T frais dans le cerveau. Lavez rapidement (< 1 min) dans l’obscurité, aspirez le surnageant de la cervelle et jetez-le.
- Répétez le lavage avec PBS/T dans l’obscurité à température ambiante selon le calendrier suivant : 2 lavages rapides (< 1 min), 1 X 5 min, 3 X 20 min et 1 X 1 h de lavage. Fixez les couvercles sur les tubes de microcentrifugation et placez les tubes sur un nutator entre les lavages.
- Si une coloration au DAPI est souhaitée, remplacer le lavage final de 1 h par 1 lavage de 30 minutes d’incubation avec 250 ng/mL de DAPI dilué dans du PBS/T, suivi de 2 lavages rapides et de 1 lavage de 20 minutes.
- Après le dernier lavage, retirez la majorité du surnageant du tampon de lavage, en prenant soin de ne pas déranger le cerveau, et ajoutez 30 μL de réactif anti-décoloration à base de glycérol dans le cerveau. Incuber à 4 °C dans l’obscurité sans bouger pendant au moins 1 h et jusqu’à 24 h.
3. Montage du cerveau entier
- Placez une lame de microscope en verre sous un microscope à dissection et étiquetez-la avec des informations d’identification.
REMARQUE : Alternativement, les cerveaux peuvent être montés directement sur une vitre de protection pour accéder aux deux côtés du cerveau pendant l’imagerie. Un protocole décrivant cette procédure de montage a déjà été publié45.
- Retirez les cerveaux de chaque tube de microcentrifugation à l’aide d’une pointe de pipette émoussée (préparée à l’aide d’une lame de rasoir pour retirer le fond à ~ 1 cm d’une pointe de 1-200 μL) et transférez-les au milieu de la lame. Transférez le moins de réactif anti-décoloration possible avec le cerveau.
- À l’aide d’une pince, positionnez le cerveau dans l’orientation souhaitée (p. ex., dorsal pointant vers le haut de la lame et face antérieure vers le haut pour l’imagerie du lobe antennaire). Lors de l’orientation du cerveau, tenez compte du trajet lumineux du microscope à utiliser pour les imager.
- Retirez l’excès de réactif anti-décoloration de la lame à l’aide du coin pointu d’un tissu de laboratoire plié sans déranger le cerveau. Laissez la diapositive reposer pendant ~ 5 à 10 minutes dans l’obscurité pour permettre aux cerveaux d’adhérer à la diapositive.
- Entourez les cerveaux de mouches avec quatre petits morceaux de verre de couverture brisé placés de chaque côté des cerveaux pour former un carré de ~ 19 mm x 19 mm. Placez un bord d’un verre de protection n° 1.5 de 22 mm x 22 mm juste à l’extérieur de l’un de ces petits morceaux de verre, et abaissez doucement la lamelle sur les cerveaux pour terminer le montage du pont.
- Distribuez lentement un réactif anti-décoloration frais pour remplir la surface sous la lamelle, en faisant attention de ne pas déranger la lamelle ou la cervelle. Essuyez tout excès d’anti-décoloration à l’aide du coin pointu d’un mouchoir de laboratoire plié sans entrer directement en contact avec la lamelle.
- Ajoutez une goutte de vernis à ongles transparent à séchage rapide aux quatre coins de la lamelle. Laisser sécher pendant ~ 10 min. Ensuite, scellez les quatre bords de la lamelle avec du vernis à ongles pour enfermer complètement les cerveaux.
- Imagez immédiatement les cerveaux ou conservez-les à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts.
- Si vous imagez la fluorescence intrinsèque à partir de fusions de protéines fluorescentes Htt, imagez les cerveaux dans les 24 heures pour obtenir le meilleur signal.
4. Imagerie et quantification de la transmission d’agrégats de type prion
- Imagez les cerveaux montés à l’aide d’un microscope confocal équipé d’un objectif à huile 40X ou 60/63X pour collecter des images en coupe z à travers la région du cerveau où les pilotes Gal4 et QF sélectionnés sont exprimés (Figure 2A, B).
- Excitez les fusions de protéines fluorescentes ou les protéines immunomarquées à l’aide des lasers appropriés (par exemple, 488 nm pour GFP/YFP/FITC ou 552 nm pour mCherry/Cy3). Définissez des fenêtres de détection qui capturent un signal fluorescent maximal tout en éliminant la diaphonie des canaux à l’aide d’un système de détection spectrale ou de filtres d’émission passe-bas/passe-long spécifiques à chaque fluorophore.
REMARQUE : Soyez attentif lors de l’imagerie des agrégats de protéines. Il est facile pour les pixels au centre de chaque agrégat de devenir saturés, en particulier dans les agrégats plus grands. Essayez de minimiser la saturation de l’image, mais soyez conscient du risque de perte de signal d’espèces agrégées plus petites (Figure 2B, C, D). Trop de saturation augmentera l’arrière-plan de l’image, ce qui rendra plus difficile l’identification des points isolés. Testez différents paramètres d’imagerie pour optimiser avant de prendre les images finales dans chaque ensemble de données.
- Analysez les données en quantifiant les points individuels, soit manuellement en parcourant les tranches z individuelles (par exemple, Figure 2C et Figure 4A), soit après avoir rendu les tranches confocales en 3 dimensions (Figure 3A, B).
note: Cela peut être fait dans Image J ou un autre logiciel de traitement d’image.
- Si les agrégats sont bien séparés et que la fluorescence de fond est minimale, utilisez un logiciel d’analyse d’images pour identifier, quantifier et analyser systématiquement les agrégats en tant qu'« objets » ou « surfaces » distincts dans une reconstruction 3D de l’empilement confocal (Figure 3B).
note: Les actions logicielles décrites sont spécifiques à l’instrument et au logiciel utilisés ici (voir le tableau des matériaux).
- Visualisez une série z confocale en mode de visualisation 3D. Utilisez l’assistant « Analyse » pour identifier des points individuels dans un canal sélectionné (par exemple, le canal rouge pour les agrégats HttQ91-mCherry dans la figure 3). Ajustez le seuillage et les filtres pour représenter avec précision tous les agrégats de taille hétérogène en tant qu’objets individuels dans l’image.
- Activez l’option « Diviser les objets » sous « Préfiltre de traitement binaire » pour séparer les agrégats étroitement associés qui sont fusionnés de manière aberrante par l’algorithme du logiciel. Notez que le nombre total d’objets et leurs mesures associées sont indiqués sous "Mesures
note: Cette méthode de quantification des agrégats mutants de Htt ne se prête pas au protocole d’immunomarquage car le centre des agrégats amyloïdes est impénétrable aux anticorps. En conséquence, les agrégats apparaissent au microscope sous forme de structures en forme d’anneau et le logiciel d’analyse d’images est incapable d’identifier et de distinguer ces « points individuels » avec précision.
- Quantifiez les agrégats Htt de type sauvage en vous déplaçant manuellement dans la pile z et en notant les agrégats Htt de type sauvage, en veillant à ce qu’aucun agrégat ne soit noté deux fois s’ils apparaissent dans plus d’une tranche (Figure 4A).
note: Cette approche de quantification manuelle peut être utilisée lorsque le nombre d’agrégats dans chaque pile confocale est raisonnable (par exemple, 20-50). Il est également utile lorsque les logiciels d’analyse d’images ne peuvent pas distinguer les points individuels du signal environnant dans le même canal (par exemple, le signal du Htt diffus de type sauvage dans les cellules voisines) (Figure 2B, C et Figure 4A). La quantification des agrégats de Htt de type sauvage peut également être difficile, car de nombreuses structures normales du cerveau semblent ponctuées (par exemple, les processus cellulaires et les synapses). La co-localisation des signaux Htt de type sauvage et mutants peut être utilisée comme critère de sélection ; cependant, il est possible que certaines « graines » mutantes de Htt tombent en dessous de la limite de détection du confocaux. Une protéine autre que Htt qui ne s’agrège pas dans les cellules réceptrices (par exemple, GFP) peut être utilisée pour marquer des structures ponctuées non apparentées dans le cerveau.
- Utilisez un logiciel d’analyse d’images pour effectuer une caractérisation plus poussée des agrégats individuels. Par exemple, déterminez la distribution granulométrique des agrégats (Figure 3C), le pourcentage de co-localisation entre les protéines Htt mutantes et de type sauvage (Figure 4A), ou mesurez directement les interactions protéine-protéine à l’aide de FRET (Figure 4B).
- Déterminez la distribution de la taille des points individuels à l’aide d’un algorithme de détection ponctuelle ou de surface qui identifie avec précision tous les agrégats visibles dans un canal particulier. Utilisez le logiciel d'analyse d'images pour prendre des mesures pertinentes des points ou des surfaces, par exemple obtenir des informations sur le « diamètre global » (Fig. 3C), le « volume » ou l'« intensité » à partir de la section « Mesures » de l'assistant « Analyse » du logiciel décrit à l'étape 4.2.1.
note: Dans la figure 3C, nous rapportons la distribution des diamètres pour tous les puncta HttQ91-mCherry identifiés dans un seul glomérule DA1.
- Déterminez le pourcentage de co-localisation entre les agrégats HttQ25-YFP et HttQ91-mCherry en vous déplaçant manuellement tranche par tranche à travers une pile z confocale (la méthode la plus précise). Attention toutefois à ne pas compter deux fois les agrégats. Pour éviter cela, ne comptez les agrégats dans une tranche z particulière que si le plan de mise au point passe par le centre de l’agrégat (Figure 4A).
- Calculez l’efficacité FRET pour les agrégats HttQ25-YFP induits avec un signal HttQ91-mCherry colocalisé à l’aide de la méthode de photoblanchiment par accepteur.
- Tout d’abord, éliminez la diaphonie potentielle entre les canaux YFP et mCherry en établissant des fenêtres de détection pour les signaux mCherry uniquement et YFP uniquement qui ne produisent aucun signal dans l’autre canal. À l'aide de ces paramètres, prenez une « image avant » de la puncta HttQ25-YFP individuelle et de leur signal HttQ91-mCherry associé (Figure 4B).
- Ensuite, photoblanchissez le signal mCherry en ajustant le laser rouge (par exemple, 552 nm) à une intensité de 100 % et balayez jusqu’à ce que le signal disparaisse. Revenez aux paramètres utilisés pour l'image avant et prenez une image après du même point (Figure 4B).
- Calculez les mesures d’intensité de fluorescence pour chaque point avant et après le photoblanchiment à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.
- Calculez l'efficacité FRET en soustrayant la fluorescence du donneur YFP mesurée dans l'image « avant » (YFPinitial) de la fluorescence du donneur YFP dans l'« image après » (YFPfinal). Divisez cette valeur par YFPfinal et multipliez par 100,
note: L’efficacité FRET peut être calculée pixel par pixel ou globalement pour chaque agrégat HttQ25-YFP (Figure 4B). Le photoblanchiment par accepteur est une technique particulièrement utile pour calculer l’efficacité FRET lorsque le signal mCherry associé à chaque punctum HttQ25-YFP est suffisamment élevé pour produire une extinction YFP détectable après le photoblanchiment mCherry.
