Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de la souris pour la chirurgie
- Retirez la souris de la cage domestique et pesez (g).
- Placez la souris dans une chambre d’induction d’isoflurane et réglez l’oxygène à 2 L/min et le vaporisateur d’isoflurane à 5 pour induire un plan chirurgical d’anesthésie, environ 3 à 5 min. Surveillez le ralentissement de la respiration et l’immobilisation. Vérifiez que la souris est complètement sous sédation à l’aide du réflexe de pincement des orteils.
- Lorsque la souris est complètement sédative, placez-la dans un cadre stéréotaxique et fixez le nez dans le cône nasal, qui est fixé à l’isoflurane à l’aide d’un tube. Insérez des barres d’oreille dans le conduit auditif et serrez en veillant à ce que la tête soit stable.
- Rasez la tête d’une oreille à l’autre et d’entre les yeux vers l’arrière des oreilles.
- Stérilisez la peau avec des lingettes alternées d’alcool isopropylique et de solution de bétadine iodée, 3 fois chacune.
- Appliquez des larmes artificielles sur les deux yeux pour éviter qu’ils ne se dessèchent pendant l’intervention chirurgicale.
2. Intervention chirurgicale
- Surveillez la profondeur de l’anesthésie en pinçant l’orteil ou la queue. La souris est dans le plan chirurgical approprié lorsqu’il n’y a pas de réponse et que la respiration est lente et régulière.
- Faites une incision cutanée parasagittale de l’arrière des yeux jusqu’à presque entre les oreilles en un seul mouvement ferme à l’aide d’une lame de scalpel n° 11. Écartez la peau et coupez le côté droit avec l’hémostat.
- Nettoyez le crâne de la membrane sus-jacente à l’aide du côté émoussé du scalpel n° 11 et des applicateurs à bout de coton. Si vous le souhaitez, essuyez le crâne à l’aide d’un applicateur à embout de coton imbibé d’une solution saline à 0,9 %. Laisser sécher complètement.
- À l’aide d’une petite règle, marquez le bord antérieur de la craniotomie à 1 mm caudal de la suture coronale et le bord gauche de la craniotomie à 1 mm latéralement de la suture sagittale (Figure 1) avec un marqueur permanent. Marquez ensuite les bords droit et caudal de la craniotomie à 4 mm des sutures sagittales et coronales, respectivement (Figure 1).
- À l’aide d’un foret de 0,5 mm, commencez à faire une craniotomie en perçant lentement en suivant le contour du marqueur permanent. Assurez-vous de ne pas percer complètement le crâne. Appuyez doucement sur le morceau isolé de l’os pariétal avec la pince n ° 5, les zones de faiblesse céderont la place à la pression. Lorsque l’os aminci est suffisamment faible sur tout le périmètre, le morceau d’os est prêt à être retiré.
note: Si l’enquêteur éprouve des difficultés à retirer l’os en un seul morceau, cela suggère que l’os n’a pas été suffisamment aminci pendant le forage. Envisagez de percer davantage le crâne chez les animaux suivants pour faciliter le retrait du morceau d’os.
- À l’aide d’une seringue de 10 ml munie d’une aiguille de 23 G, appliquez une petite quantité de solution saline à 0,9 % pour tremper l’os isolé et la zone percée.
- Fixez le bras manipulateur à l’équipement stéréotaxique. Fixez une nouvelle lame de scalpel n° 11 sur le porte-sonde avec le côté tranchant de la lame orienté vers le rose.
note: Bien que les tissus rostral et caudal subissent respectivement les bords tranchants et émoussés de la lame, les dommages mécaniques induits par la blessure pénétrante sont comparables dans toute l’étendue de la lésion. Nous n’observons aucune différence appréciable dans les principales caractéristiques de la gliose réactive, y compris la régulation à la hausse de l’expression ou la prolifération de GFAP, entre les sections rostrale et caudale.
- En gardant le bras manipulateur à l’écart, soulevez délicatement l’os isolé à l’aide d’une pince coudée 5/45. Insérez la pointe de la pince dans le côté de l’os isolé et soulevez, à l’aide de l’effet de levier, pour retirer le morceau d’os laissé derrière en un seul mouvement complet.
note: Attention à ne pas poignarder le cerveau ou déranger la dure-mère sous le crâne.
- Prenez un petit morceau de la mousse de gel résorbable trempée et placez-le sur le cerveau découvert pour l’empêcher de se dessécher et absorber le sang qui pourrait être présent.
- Une fois la mousse de gel en place, faites pivoter le bras manipulateur en place et ajustez la lame au centre de la craniotomie sur la mousse de gel. Retirez la mousse de gel et abaissez la lame jusqu’à ce que la pointe touche la dure-mère sans percer la dure-mère. Marquez les coordonnées dorsales/ventrales à l’aide de l’échelle de vernier sur le bras vertical de la stéréotaxie.
- À l'aide du bras du manipulateur, abaissez lentement la lame à 3 mm près de l'encéphale. Ceci est réalisé en utilisant les repères de l’échelle vernier sur le bras manipulateur. Laissez la lame rester en place pendant 5 à 10 secondes. Déplacez trois fois le bras stéréotaxique avec fixation de la lame rostrale à caudale, permettant à la lame d’atteindre les limites rostrale et caudale de la craniotomie avant de se déplacer vers l’extrémité opposée.
note: La dure-mère n’est pas retirée avant d’insérer la lame. Contrairement à la dure-mère du rat, qui a une épaisseur de ~80 μm7, la dure-mère de souris est considérablement plus fine (seulement quelques couches cellulaires d’épaisseur) et ne produit pas une résistance appréciable à la lame du scalpel lors de l’insertion. Utilisez une nouvelle lame de scalpel pour chaque souris afin de vous assurer que chaque animal reçoit une blessure constante.
- Soulevez lentement le bras stéréotaxique, en retirant la lame du cerveau. Après avoir retiré la lame, placez immédiatement un autre morceau de mousse de gel sur la surface du cerveau pour absorber tout excès de sang ou de liquide.
- Pendant ce temps, retirez le bras stéréotaxique et jetez la lame de scalpel n° 11. Une fois que le saignement s’est arrêté, retirez la mousse de gel.
- Fermez la plaie en suturant la peau avec des sutures non résorbables, comme l’éthilon ou le prolène. Les sutures doivent être retirées 9 à 10 jours après la chirurgie.
- Remettez la souris dans sa cage d’origine et laissez-la se rétablir lentement sur un coussin chauffant et surveillez tout signe de détresse. La récupération de l’anesthésie induite par l’isofluorane se produit généralement dans les 2 à 5 minutes suivant le retrait de l’isofluorane. Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait retrouvé sa position couchée sternale.
- Administrer 0,5 à 1 ml de solution de Ringer lactée par voie sous-cutanée pour assurer l'hydratation.
