Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Prélèvement d’organes et détermination des charges bactériennes
- Après la perfusion, prélever des organes (p. ex. foie, rate) en retirant soigneusement le système vasculaire et les ligaments attachés et en plaçant les organes séparément dans un tube conique stérile de 15 ml contenant 5 ml de PBS stérile froid (4 °C). Conservez les échantillons sur de la glace jusqu’à ce qu’un traitement ultérieur soit effectué.
- Pour récolter le cerveau, décapitez la tête derrière les oreilles à l'aide de ciseaux et coupez la peau du cuir chevelu entre les yeux de l'animal le long de la ligne médiane. Si nécessaire, coupez l’excès de tissu, en gardant les ciseaux pressés contre le crâne.
- Insérez doucement une pointe des ciseaux dans le foramen magnum (le trou à la base du crâne par lequel passe la moelle épinière) et coupez latéralement dans le crâne des deux côtés.
- Coupez doucement le crâne entre les yeux du rongeur le long de la ligne médiane, en appliquant une pression latérale. Évitez de perturber le cerveau et maintenez un contact minimal entre le tissu cérébral et les ciseaux.
- À l’aide d’une pince à pointe fine, ouvrez le crâne pour exposer le cerveau et placez une spatule entre le dessous du cerveau et la base du crâne pour retirer le cerveau.
note: Cela entraîne la déchirure des fibres nerveuses du cerveau.
- Transférez soigneusement le cerveau dans un tube conique de 15 ml contenant 5 ml de PBS froid stérile.
- Jetez la carcasse de souris et répétez ces étapes pour les animaux restants.
note: Une fois que tous les organes ont été prélevés, nettoyez la zone de procédure et préparez-vous à l’homogénéisation des organes pour déterminer les charges bactériennes.
- Nettoyez et stérilisez l’extrémité d’un homogénéisateur de tissus placé dans une enceinte de biosécurité en insérant l’embout et en faisant fonctionner l’homogénéisateur pendant 10 s séquentiellement dans de l’eau de Javel à 5 %, de l’eau stérile, de l’éthanol à 75 % et de l’eau stérile, chacun contenu dans un tube conique distinct de 15 ml.
- Homogénéiser le cerveau infecté (~20 s sur le réglage 6, régime maximal) dans le tube conique de 15 mL jusqu’à ce qu’il ne reste plus de fragments de tissu visibles.
- Nettoyez l’homogénéisateur comme décrit à l’étape 1.3 pour éviter la contamination bactérienne par transfert vers l’échantillon d’organe suivant.
- Effectuez le processus d’homogénéisation pour tous les autres organes (par exemple, le foie, la rate).
- Une fois le processus d’homogénéisation terminé, nettoyez l’homogénéisateur comme décrit à l’étape 1.3 et rangez-le jusqu’à ce qu’il soit utilisé ultérieurement.
- Préparer des dilutions en série de 10 fois des homogénats d’organes dans du PBS stérile et mettre les dilutions en plaques sur des plaques d’agar-agar/streptomycine BHI pour déterminer l’UFC par organe.
REMARQUE : Une méthode similaire est utilisée pour déterminer l’UFC par mL de sang.
- Une fois toutes les dilutions préparées, transférez les plaques dans un incubateur à 37 °C pendant la nuit.
- Le lendemain, comptez le nombre de colonies sur chaque plaque pour déterminer le nombre total de bactéries par organe ou mL de sang comme suit :
UFC/organe = (nombre de colonies x facteur de dilution) / mL d’homogénat plaqué x 5
UFC/mL de sang = (nombre de colonies x facteur de dilution) / mL de sang plaqué