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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Protocole d’immunofluorescence
- Dissection tissulaire
- Sacrifiez le poisson-zèbre par immersion dans de l’eau glacée (5 parties de glace / 1 partie d’eau, 4 °C) ; laissez-les jusqu’à l’arrêt de tout mouvement pour assurer la mort par hypoxie.
- Retirez la tête avec une lame de rasoir. Retirez les tissus mous de la face ventrale du crâne à l’aide d’une pince. Ouvrez le crâne et retirez l’os de la face ventrale du cerveau. Retirez la peau et les os du crâne de la face dorsale du cerveau. Retirez le cerveau.
- Fixation tissulaire
- Fixer le cerveau par immersion pendant 3 h dans du paraformaldéhyde à 4 % (PFA) à 4 °C.
- Préparez un tampon phosphaté (PB) 0,1 M en dissolvant 1,755 g de NaH2PO4H2O et 4,575 g de Na2HPO4 dans 450 mL d’eau distillée (dH2O) et ajustez à un pH de 7,4 avec la quantité nécessaire de NaOH 1N.
- Préparez 4 % de PFA en dissolvant 4 g de PFA dans 100 mL de 0,1 M de PB (pH 7,4) en agitant sur une plaque chauffante. Lorsqu’une température de 60 °C est atteinte, ajoutez 2 à 4 gouttes de NaOH 1N pour obtenir une solution claire. Laisser le PFA 4 % à température ambiante (RT) et contrôler le pH. Ajustez le pH à 7,4.
note: Le temps de fixation dépend de la taille des tissus. La fixation tissulaire pendant plus de 4 à 6 heures peut entraîner une surfixation, qui masque les antigènes et limite la liaison anticorps-épitope.
- Enrobage tissulaire
- Rincez les mouchoirs 3 fois pendant 5 minutes chacun, avec 0,1 M PB (pH 7,4).
- Pour la cryoprotection, transférez les tissus à 20 % de saccharose dans du PB (0,1 M, pH 7,4) et conservez-le toute la nuit à 4 °C. Ensuite, transférez les tissus à 30 % de saccharose dans 0,1 M PB (pH 7,4) et conservez-le une nuit supplémentaire à 4 °C.
- Intégrez les tissus dans un bloc de composé à température de coupe optimale (OCT). Pour ce faire, préparez un petit dewar d’azote liquide, prenez du papier d’aluminium et coupez-le en deux pour créer une casserole. La casserole contenant les tissus remplis de composé OCT doit être trempée dans l’azote liquide jusqu’à ce que le composé OCT soit refroidi. Les tissus congelés peuvent être conservés à -80 °C jusqu’à la section.
- Découpe de tissus
- Transférez les blocs de tissus congelés dans un cryostat à -20 °C et coupez-les en coupes coronales ou sagittales de 10 μm.
- Prélever les tissus en alternance sur des lames de verre adhésives adaptées à l’immunohistochimie et les stocker à -20 °C jusqu’à utilisation.
note: Stockez les diapositives entre -20 °C et 4 °C dans une boîte de diapositives sombre ou un livre de diapositives.
- Blocage des sites de liaison non spécifiques et perméabilisation tissulaire
- Délimitez la zone tissulaire de la lame à l’aide d’un stylo résistant aux solvants.
- Rincez les sections 3 fois pendant 5 minutes chacune, avec 0,1 M PB (pH 7,4).
- Incuber les sections avec 1 % de sérum d’ânesse normal dissous dans le tampon de perméabilisation PB-Triton X-100 0,3 % (PB-T) pendant 30 min à RT pour perméabiliser la membrane cellulaire et bloquer les sites de liaison non spécifiques.
- Préparez Triton X-100 0,3 % en dissolvant 0,3 mL de Triton X-100 dans 100 mL de 0,1 M PB (pH 7,4).
- Préparez la solution bloquante en dissolvant 1 % de sérum d’âne normal dans du PB contenant 0,3 % de TritonX-100.
note: Les espèces animales du sérum utilisées dans les tampons de perméabilisation et de blocage dépendent de l’hôte de l’anticorps secondaire.
- Incubation avec mélange d’anticorps primaires
- Rincez les sections 3 fois pendant 5 minutes chacune, avec 0,1 M PB (pH 7,4).
- Incuber les sections pendant la nuit dans une boîte humide à RT avec un mélange d’anticorps primaires dilués dans du PB-T. Les mélanges suivants d’anticorps primaires peuvent être utilisés : anticorps de chèvre contre le récepteur de l’orexine (OX-2R) dilué 1:100 / anticorps de lapin contre le récepteur cannabinoïde (CB1R) dilué 1:100, ou anticorps de chèvre contre le peptide d’orexine (OX-A) dilué 1:100 / anticorps de lapin contre le récepteur CB1R dilué 1:100.
- Incubation avec mélange d’anticorps secondaires
- Rincez les sections 3 fois pendant 5 minutes chacune, avec 0,1 M PB (pH 7,4).
- Incuber les sections pendant 2 h à RT avec 1) un mélange d’anticorps secondaire conjugué anti-lapin Alexa Fluor 488 et d’anticorps secondaire anti-chèvre Alexa Fluor 594 dilué 1:100 dans PB-T ; ou 2) un mélange d’anticorps secondaire conjugué anti-chèvre Alexa Fluor 488 et d’anticorps secondaire conjugué anti-lapin Alexa Fluor 594 dilué 1:100 dans PB-T.
note: Utilisez des anticorps secondaires développés chez le même hôte animal. Le sérum normal doit appartenir à la même espèce d’anticorps secondaires (par exemple, utilisez des anticorps secondaires développés chez l’âne et un sérum normal d’âne). Diluez les anticorps primaires et secondaires avec un tampon bloquant contenant le détergent pour augmenter la perméabilisation cellulaire et réduire le bruit de fond.
- Montage de tissus
- Rincez les sections 3 fois pendant 5 minutes chacune, avec 0,1 M PB (pH 7,4).
- Contre-colorer les sections avec un colorant nucléaire DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole) préparé en dissolvant 1,5 μL de DAPI (1 mg/mL) dans 3 mL de PB.
- Glissières de lamelle avec support de montage (voir tableau des matériaux). Ce milieu de montage aqueux stabilise l’échantillon de tissu et colore pour une utilisation à long terme. Les échantillons fluorescents peuvent être conservés dans l’obscurité à 4 °C. Pour prolonger la durée de vie des fluorophores, utilisez un support de montage anti-décoloration.
note: Choisissez un bon support de montage. L’un des paramètres les plus importants des agents de montage est l’indice de réfraction (nD), qui doit être d’environ 1,5, l’indice de réfraction du verre. Le milieu de montage utilisé ici peut être utilisé en particulier avec des échantillons préparés pour la détermination des enzymes et des lipides (c’est-à-dire des échantillons qui ne doivent pas être déshydratés avec une série ascendante d’alcool).
- Contrôles
- Répéter les sections 1.1 à 1.8, en omettant l’anticorps primaire ou secondaire, ou en remplaçant l’antisérum primaire ou secondaire par du PB (contrôle négatif).
- Répéter les sections 1.1 à 1.8, en préabsorbant chaque anticorps primaire avec un excès du peptide relatif (100 mg de peptide/1 mL d’antisérum dilué).
- Répéter les sections 1.1 à 1.8 sur des tranches de cerveau de souris (contrôle positif).
note: Préparez tous les tampons frais, peu de temps avant de commencer. Retirez soigneusement l’excès de liquide à chaque étape avec une pipette ou du papier filtre autour des sections, en gardant toujours la section humide.