1. Établir le modèle BBB
Remarque : Pour établir le modèle de barrière hémato-encéphalique (BHE), nous suggérons d’utiliser des cellules endothéliales microvasculaires microvasculaires primaires (RBMEC) et des astrocytes corticaux de rat (RCA) disponibles dans le commerce. Toutes les étapes doivent être effectuées avec des réactifs stériles et des produits jetables manipulés dans une hotte à flux laminaire.
- Culture cellulaire
- Enduire les flacons de culture cellulaire de poly-L-lysine 100 μg/ml (1 h à température ambiante, RT) ou de fibronectine 50 μg/ml (1 h à 37 °C) pour favoriser la fixation des RCA ou des RBMEC, respectivement. Ensuite, décongelez 1 x 106 RCA et 5 x 105 RBMEC dans un milieu de cellules endothéliales, complétés par 5 % de sérum de veau fœtal, 1 % de supplément de croissance des cellules endothéliales et 1 % de pénicilline/streptomycine (sECM). Seed RCA dans un ballon T175 dans une sECM de 20 ml et RBMECs dans un ballon T75 dans une sECM de 10 ml.
Remarque : Les passages de décongélation et d’ensemencement des RCA et des RBMEC doivent être ajustés en termes de densité cellulaire et de temps en culture en fonction du nombre de conditions expérimentales à tester avec le modèle BHE. En commençant avec 1 flacon de 1 x 106 RCA et 1 flacon de 5 x 105 RBMEC, il est possible d’obtenir jusqu’à 20 inserts de roulement BBB.
- Maintenir les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 dans une atmosphère humidifiée pendant environ 6 jours jusqu’à environ 80 % de confluence pour les RCA et plus de 90 % de confluence pour les RBMEC. Détacher les cellules à l’aide d’une solution d’acide trypsine-éthylènediamine tétraacétique (trypsine-EDTA) (trypsine 1:250) pendant 5 min (1 ml de trypsine pour les fioles T75 et 2 ml pour les fioles T175). Arrêter l’activité de la trypsine avec la sECM (2:1), centrifuger les suspensions cellulaires à 750 × g pendant 5 min, et remettre les pastilles en suspension dans 60 ml de sECM.
- Divisez les RBMEC en 3 flacons T175 et cultivez-les dans sECM pendant encore 3 jours avant de les semer sur des inserts. Comptez le nombre total d’ACR vivants en observant une suspension cellulaire diluée 1:1 avec du bleu de trypan sous un microscope optique dans une chambre de Burker.
- Ensemencement cellulaire sur inserts
- Traiter une face de la membrane en polyéthylène téréphtalate (PET) de 6 inserts transparents multi-puits avec de la poly-L-lysine 100 μg/mL et l’autre face avec de la fibronectine 50 μg/mL, pour permettre la fixation des RCA et des BMEC. Manipulez les inserts avec une pince à épiler afin d’éviter tout contact avec la membrane PET.
- Placez les inserts dans une plaque à 6 puits et ajoutez une solution de fibronectine (minimum 500 μl) dans la chambre supérieure. Après 1 heure d’incubation à 37 °C, retirez la solution de fibronectine, retirez les inserts de la plaque multi-puits et placez-les à l’envers au fond d’une boîte de Pétri de 150 cm2, qui sert ici de support stérile pour les inserts déjà revêtus.
- Ajoutez doucement 800 μl de poly-L-lysine sur la face inférieure de l’insert (comme illustré à la figure 1A, ce qu’on appelle l’ensemencement des RCA) et conservez la solution sur les inserts pendant 1 heure à RT.
- Aspirez la solution et laissez sécher les inserts à RT pendant 15 à 30 min. Les inserts sont maintenant prêts pour l’ensemencement cellulaire, mais peuvent également être stockés dans la plaque multi-puits pendant plusieurs jours à 4 °C avant de procéder à la construction BBB.
Remarque : N’oubliez pas de garder au moins 3 inserts revêtus exempts de cellules à utiliser comme témoins pour valider l’établissement de la BHE par des mesures de flux FD40.
- Semez les ACR (35 000/cm2) sur la face inférieure des inserts enrobés de poly-L-lysine en déposant 800 μl de suspension cellulaire sur l’insert renversé (figure 1A). Laisser la suspension RCA sur les inserts pendant 4 h à RT afin de permettre une fixation efficace des cellules à la membrane.
- Aspirez la solution résiduelle, placez les inserts dans des puits contenant 2 ml de sECM et maintenez la plaque multi-puits à 37 °C et 5 % de CO2 dans une atmosphère humidifiée, en changeant la sECM tous les 2 jours.
- Après 3 jours, lorsque les ACR ont recouvert la face inférieure de l’insert, ensemencez les RBMEC sur la face supérieure de l’insert, en suivant ces étapes :
- Détacher les RBMEC des flacons T175 et compter le nombre total de cellules vivantes, comme indiqué aux étapes 1.1.2 et 1.1.3.
- Semez des RBMEC (60 000/cm2) sur la surface supérieure de l’insert en sECM (1 000 μl) (Figure 1B), en laissant 3 inserts avec les astrocytes uniquement, à utiliser comme fond de résistance électrique transendothéliale (TEER). Placez la plaque multipuits dans des conditions de culture standard. Maintenez le système en culture pendant au moins 3 jours, en changeant la sECM dans la chambre intérieure et inférieure tous les 2 jours.
2. Validation BBB
- Mesure TEER
- Le 3ème jour de la co-culture, vérifiez le TEER en insérant les inserts portant la BHE dans une chambre appropriée (avec un capuchon et où la chambre et le capuchon contiennent une paire d’électrodes de détection de tension et de courant), remplie de 4 ml de sECM. Connectez-vous à un volt/ohmmètre de tissu épithélial.
- En même temps que les mesures TEER des systèmes BBB de cellule, enregistrez les valeurs TEER des 3 inserts portant les RCA qui seront soustraits des valeurs obtenues avec les BBB. Multipliez les valeurs TEER résultantes par la surface de l’insert (4,2 cm2) afin d’exprimer les résultats comme Ω x cm2.
- À partir du 3ème jour de co-culture, mesurez le TEER tous les jours. note: Après une période initiale au cours de laquelle le TEER augmente, les valeurs enregistrées doivent rester stables pendant au moins deux jours consécutifs (généralement entre le 5e et le 7e jour de co-culture). À ce stade, la BHE est prête pour la deuxième étape de validation (section 2.2) et/ou pour les expériences trans-BBB.
Remarque : La procédure décrite au point 2.1 peut être effectuée sur les mêmes systèmes de BHE consacrés aux expériences de perméabilité suivantes (point 3). Opérer dans des conditions stériles.
3. Perméation trans-BBB des ferritines chargées de FITC (FnN)
Remarque : Une variante recombinante de la ferritine humaine (Fn), produite chez Escherichia coli et assemblée dans des nanocages (FnN). Les FnN sont chargés en isothiocyanate de fluorescéine (FITC), et les concentrations de Fn et des molécules chargées sont déterminées avec précision.
- Flux trans-BBB de FITC et FITC-FnN
- Mesurer le flux FITC-FnN de la chambre supérieure à la chambre inférieure des modèles de BHE validés (généralement au 5e au 7e jour de la co-culture), par rapport à celui du colorant libre après 7 et 24 heures d’incubation, selon les étapes suivantes :
- Ajouter le FITC-FnN (50 μg/ml FnN, 1,1 μM FITC) ou une quantité égale de FITC libre dans la chambre supérieure d’au moins 6 systèmes de BHE pour chaque formulation, afin de prélever 2 ml de solution sECM de la chambre inférieure d’au moins 3 inserts après 7 heures, et de la chambre inférieure des 3 autres inserts après 24 heures.
- Mesurer l’intensité de fluorescence de 500 μl des échantillons collectés à l’aide d’un spectrofluorimètre (λex 488 nm, λem 515 nm, fente 5).
- Obtenez la fluorescence de fond sECM en mesurant 500 μl de milieu en utilisant les mêmes paramètres analytiques. Soustrayez la fluorescence de fond sECM de toutes les valeurs de fluorescence FITC ou FITC-FnN.
- Déterminer la concentration de FITC ou FITC-FnN perméatée en comparant les valeurs de fluorescence obtenues avec deux courbes d’étalonnage différentes produites avec des concentrations connues (c’est-à-dire 6,87, 13,75, 27,5, 55 nM) du colorant libre ou nanoformulé dissous dans 500 μl de sECM.
