Mesure de l’activité du protéasome dans différents compartiments subcellulaires du cerveau du rat

1. Dosage de l’activité du protéasome

REMARQUE : L’activité du protéasome peut être mesurée dans du tissu cérébral homogénéisé à l’aide d’une version légèrement modifiée du kit d’activité du protéasome 20S. Ce test ne mesure pas directement l’activité des complexes complets de protéasome 26S. Au lieu de cela, il mesure l’activité du noyau 20S, ce qui signifie qu’il ne peut servir que d’indicateur pour comprendre l’activité du noyau lui-même par opposition à l’ensemble du complexe protéasome 26S. Le succès de ce test diminue avec des cycles répétés de congélation-décongélation et/ou des niveaux croissants de détergents, en particulier ioniques, et nécessite l’utilisation d’un lecteur de plaques avec un jeu de filtres 360/460 (excitation/émission) et des capacités de chauffage allant jusqu’à 37 °C.

1. Réglages du lecteur de plaques : Préchauffer à 37 °C et tenir tout au long de la course.​
   1. Réglez l’excitation sur 360 et l’émission sur 460. Si la plaque à 96 puits utilisée est claire, réglez la position de l’optique sur Bas. Si une plaque à 96 puits foncée/noire est utilisée, réglez la position de l’optique sur Haut.
   2. Réglez les anciens modèles de lecteurs de plaques sur Auto-Gain sous les options de lecture fluorescente ; les modèles plus récents sont préréglés pour cela. Programmez une course cinétique d’une durée de 2 h, en balayant (lecture) toutes les 30 min.
2. Reconstituez le tampon de dosage 10x fourni dans le kit avec 13,5 mL d’eau ultrapure. Ajoutez 14 μL de 100 mM d’ATP au tampon maintenant 1x ; Cela augmente considérablement l’activité du protéasome dans les échantillons et améliore la fiabilité du dosage. Le tampon final 20S Assay peut être stocké sur de la glace ou à 4 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin et est stable pendant plusieurs mois.
3. Reconstituer la norme AMC fournie en kit avec 100 μL de DMSO. Effectuez cette étape dans l’obscurité ou dans des conditions de faible luminosité, car la norme est sensible à la lumière.
4. Créez une courbe standard d’AMC à l’aide de l’étalon reconstitué, dans l’obscurité ou dans des conditions de faible luminosité.
   1. Dans des tubes de microcentrifugation séparés de 0,5 mL, ajoutez 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 et 0 μL de l’étalon AMC, ce qui correspond à une concentration d’AMC de 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 et 0 μM.
   2. À ces tubes, dans le même ordre, ajoutez 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 et 100 μL de tampon de dosage 20S. Cela crée une série de concentrations d’AMC élevées à faibles, qui seront utilisées pour l’étalonnage du lecteur de plaques et l’analyse de l’activité du protéasome dans les échantillons homogénéisés.
   3. Conservez tous les étalons dilués sur de la glace dans l’obscurité jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
5. Reconstituer le substrat du protéasome (Suc-LLVY-AMC) fourni en kit avec 65 μL de DMSO. Effectuez cette étape dans l’obscurité ou dans des conditions de faible luminosité, car le substrat est sensible à la lumière. Créez une dilution 1:20 du substrat du protéasome dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL à l’aide d’un tampon de dosage 20S. Conservez le substrat dilué sur de la glace dans l’obscurité jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
   note: Par exemple, si la plaque comporte 10 échantillons et 1 blanc, vous aurez besoin de suffisamment de substrat dilué pour 22 puits (avec duplicatas) à 10 μL par puits. Cela équivaut à un besoin de 220 μL + 30 μL pour les erreurs de pipetage, nécessitant 12,5 μL de substrat et 237,5 μL de tampon de dosage 20S.
6. Décongeler les échantillons désirés (s’ils sont congelés) et ajouter une quantité normalisée à une plaque de 96 puits. Exécutez chaque échantillon en double. La quantité d’échantillon nécessaire varie en fonction de la préparation des tissus. En général, 10 à 20 μg sont suffisants pour toute fraction subcellulaire.
7. Porter le volume du puits d’échantillonnage à 80 μL avec de l’eau ultrapure. La quantité ajoutée dépend du volume d’échantillon ajouté. Par exemple, si l’échantillon 1 contenait 4,5 μL de protéines et l’échantillon 2 8,7 μL, la quantité d’eau nécessaire sera respectivement de 75,5 μL et 71,3 μL. Dans deux puits séparés, ajoutez 80 μL d’eau seule ; il s’agira des Assay Blanks.
   note: Afin de limiter les changements de volume de protéines dus aux erreurs de pipetage, les concentrations de protéines peuvent être normalisées à l’échantillon le moins concentré. Cela permettra d’utiliser le même volume d’échantillon dans toutes les conditions.
8. Ajouter 10 μL de tampon de dosage 20S dans chaque puits, y compris les blancs de dosage. Un répéteur/pipette automatisée est recommandé ici pour assurer un volume de dosage constant dans tous les puits.
9. Facultatif : À ce stade, introduisez des manipulations in vitro si vous le souhaitez, cela nécessitera que chaque échantillon dispose de 2 puits supplémentaires par traitement, y compris le véhicule. Si c’est le cas, ajoutez 5 à 10 μL de médicament/composé d’intérêt à 2 des puits d’échantillonnage et un volume équivalent de contrôle/véhicule à 2 autres puits. Placez la plaque sur le lecteur de plaque préchauffé ou dans un incubateur à 37 °C pendant 30 min.
10. Éteignez les lumières ou entrez dans une pièce sombre. Ajouter les 100 μL d’étalons AMC dilués à un nouveau puits ; Chaque étalon aura un seul puits.
11. Dans l’obscurité, ajoutez 10 μL de substrat de protéasome dilué dans les puits contenant des échantillons et des blancs d’analyse, mais pas à la norme AMC. Un répéteur/pipette automatisée est recommandé ici pour assurer un volume de dosage constant dans tous les puits.
12. Placez la plaque dans le lecteur de plaques et lancez le cycle cinétique.
    note: La plaque n’a pas besoin d’être sous agitation constante pendant le fonctionnement cinétique, cependant, l’utilisateur peut choisir de le faire s’il le souhaite
13. À la fin de l’exécution cinétique, exportez les valeurs fluorescentes brutes 360/460 vers Microsoft Excel.
    1. Faites la moyenne des puits en double pour chaque étalon, chaque échantillon et le blanc de test pour les 5 balayages. Les valeurs fluorescentes brutes doivent augmenter d’un œil à l’autre pour les échantillons, mais rester stables (ou diminuer légèrement) pour les étalons et les blancs d’essai.
    2. Prenez la moyenne de puits de l’étalon AMC le plus élevé et divisez-la par la concentration connue (20 μM). Divisez cette valeur par la concentration de l’échantillon utilisée dans le test pour obtenir une valeur AMC standardisée. Pour chaque échantillon et moyenne à blanc de dosage, divisez par la valeur AMC standardisée.
    3. Prenez cette valeur finale et divisez-la par la concentration de l’échantillon utilisée dans le test pour obtenir la valeur normalisée de chaque échantillon et du blanc de test. Faites-le pour les 5 scans.
    4. Soustrayez la valeur normalisée du blanc de test de chaque valeur d’échantillon normalisée pour les 5 balayages.