$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par l’examen éthique approprié des animaux.
1. Préparation des réactifs
- Tampon de digestion (1 ml par hémisphère) : Dissoudre un mélange normalisé d’enzymes digestives purifiées, par exemple Liberase à faible concentration de thermolysine (TL) à une concentration de 2U/ml dans une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) contenant du calcium (Ca) et du magnésium (Mg).
- Tampon de lavage à la DNAse : Dissoudre la DNAse I à une concentration de 666U/ml dans du HBSS (sans Ca/Mg (calcium/magnésium)) contenant 10 % de sérum de veau fœtal (FCS).
- Tampon de lavage sans DNAse : HBSS (sans Ca/Mg) contenant 10 % de FCS.
- Milieu à gradient de densité (5 ml par hémisphère) : préparer le milieu à gradient de densité isotonique (SIP ; 100 %) en mélangeant neuf parties de milieu à gradient de densité avec une partie de chlorure de sodium 1,5 M. Diluer le SIP à une densité de 25 % en ajoutant un volume approprié de HBSS (sans Ca/Mg) contenant 3 % de FCS.
2. Dissociation du tissu cérébral en suspensions unicellulaires
- Retirez soigneusement le tronc cérébral et le cervelet avec une lame de rasoir propre. Utilisez une lame de rasoir propre pour hémister le cerveau et coupez chaque hémisphère le long du plan coronal en trois morceaux de taille à peu près égale.
- Hacher a disséqué le tissu de chaque hémisphère à travers une passoire cellulaire de 100 μm à l’aide de l’extrémité du piston d’une seringue de 5 ml. Rincez continuellement la crépine cellulaire avec du HBSS glacé (+Ca/Mg). Conservez les échantillons homogénéisés sur de la glace.
- Centrifuger à 286 x g et 4° C pendant 5 min, jeter soigneusement le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans 1 ml de tampon de digestion et transférez la suspension dans un tube de 2 ml. Incuber la suspension sous rotation lente et continue à 37 °C pendant 1 h.
- Tamisez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 μm et rincez abondamment avec 3 ml de tampon de lavage contenant de l’ADNASE suivis de 15 ml de tampon de lavage sans DNAse. Centrifuger à 286 x g et 18 °C pendant 5 min et jeter le surnageant. note: L’utilisation de l’ADN élimine le mucus de l’ADN causé par la lyse cellulaire, ce qui pourrait conduire à l’agrégation cellulaire, compromettant la survie cellulaire.
3. Centrifugation à gradient de densité pour l’élimination de la myéline et des débris cellulaires
- Remettez la pastille en suspension dans 5 ml de milieu à gradient de densité de 25 % et pipetez la suspension dans un tube de 15 ml. Mélangez soigneusement par pipetage répété et doux, en évitant la formation de bulles. note: Un milieu à gradient de densité doit être utilisé lors de la RT pour éviter l’agglutination des cellules.
- Centrifugeuse à 521 x g et 18 °C pendant 20 min. Utilisez le profil d’accélération le plus bas du rotor et laissez le rotor s’arrêter sans frein. Retirez délicatement les tubes de la centrifugeuse sans les secouer. Aspirez soigneusement l’enveloppe de myéline et le surnageant tout en préservant la pastille cellulaire au fond du tube. note: Assurez-vous d’enlever toute la couche de myéline, car tout reste nuira à l’analyse cytométrique en flux.
- Remettez la pastille en suspension dans 10 ml de tampon de lavage sans DNAse et pipetez la suspension dans un nouveau tube de 15 ml. note: Cette étape de lavage est cruciale, car l’élimination suffisante du milieu à gradient de densité contribue de manière significative à la quantité et à la qualité de l’échantillon final de cellule.
- Centrifuger à nouveau à 286 x g et 10 °C pendant 5 min et jeter le surnageant. Réintroduire les cellules dans 100 μl de tampon de lavage à froid et déterminer le nombre de cellules et la viabilité par exclusion au bleu de trypan dans un hémocytomètre. Stockez les échantillons à 4 °C et traitez-les rapidement.