Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des réactifs et des fournitures
- Déterminer la dose, la fréquence d’évaluation et la chronologie de l’ester méthylique de la L-3,4-dihydroxyphénylalanine (lévodopa ou L-DOPA) et du chlorhydrate de bensérazide, un inhibiteur périphérique de la décarboxylase (voir le tableau des matériaux), la fréquence d’évaluation et la chronologie expérimentale appropriées pour la question de recherche (figure 1).
note: Des questions expérimentales peuvent être posées pour chercher un certain nombre de réponses, allant de la question de savoir si un traitement spécifique pourrait réduire les dyskinésies induites par la L-DOPA (LID) existantes à la prévention de l’induction de la LID. Ils peuvent également déterminer si l’efficacité thérapeutique dépend de la dose de lévodopa ou si l’expression de la LID et/ou l’efficacité thérapeutique varient en fonction du sexe, de l’espèce et de l’âge du sujet.
- Pesez les rats chaque semaine pour calculer la quantité de médicament appropriée en fonction des changements de poids continus au cours de l’étude.
note: En raison de l’activité accrue chez les rats LID+, il existe un potentiel de perte de poids avec des traitements à long terme avec la L-DOPA. En cas de perte de poids, fournissez aux rats des friandises nutritionnellement complètes et très appétissantes (voir le tableau des matériaux) après des injections de L-DOPA.
- Calculer la quantité de L-DOPA et de bensérazide nécessaire pour chaque concentration hebdomadaire, en pesant les aliquotes lyophilisées pour chaque jour d’injection et en les stockant en association pendant 1 à 2 semaines à -20 °C dans des flacons en verre ambré jusqu’au jour du traitement.
note: La dose cible est de 12 mg/kg ou 12 mg de L-DOPA/1000 g de poids corporel. Les renseignements supplémentaires fournissent un exemple de calculs permettant de déterminer la quantité de L-DOPA et de solution saline nécessaire pour chaque jour de la semaine en utilisant 12 mg de L-DOPA/kg de poids corporel à un volume d’injection de 1 cc/kg de poids de rat.
2. Mise en place de la salle et de la cage
- Le premier jour du traitement par L-DOPA, 3 à 4 semaines après la chirurgie des lésions de 6-hydroxydopamine (6-OHDA), transférez les rats dans un logement simple, y compris l’enrichissement approuvé par l’IACUC.
- Maintenir dans un logement individuel tout au long de l’étude pour éviter l’interférence des pairs avec les évaluations comportementales.
- Les jours de classement de l’ADI, placez les cages domestiques sur une grille en fil d’acier, tournée à un angle d’environ 45° pour une observation optimale du rat (figure 2A). Retournez les étiquettes d’identification (Figure 2B) vers le haut et retirez les bouteilles d’eau, les supports alimentaires et tous les types d’enrichissement dans la cage (Figure 2C) pour éviter d’interférer avec les évaluations comportementales.
3. Injections de lévodopa et indice de dyskinésie
- Injections sous-cutanées de L-DOPA
- Immédiatement avant l’injection quotidienne de L-DOPA, ajouter le volume approprié de solution saline stérile au mélange de L-DOPA et de bensérazide lyophilisé pré-pesé dans le flacon ambré et bien agiter pendant 10 s (étape 1.3).
REMARQUE : Le volume d’injection cible est de 1 mL/1000 g de poids corporel (avec 12 mg de L-DOPA par mL). Le volume de solution saline stérile dépendra du nombre d’animaux par étude.
- Remplissez des seringues individuelles (p. ex., 1,0 ou 0,5 mL avec une aiguille de 26 G) avec le volume requis pour chaque animal (1 mL/kg de poids de rat) et étiquetez chaque seringue avec l’identification individuelle de l’animal.
note: Conservez les seringues remplies à l’abri de la lumière dans des sachets stériles jusqu’au moment de l’injection. La L-DOPA s’oxyde rapidement en présence d’oxygène et de lumière dans un environnement aqueux.
- Amenez la première cage sur le banc d’injection.
- Retirez le rat de sa cage et placez-le sur la surface d’injection.
- Maintenez doucement la tête et les épaules contre la surface sur laquelle le rat se repose avec la paume de la main non dominante.
- Frottez doucement la peau du dos recouvrant les omoplates avec le pouce et l’index de la main non dominante. Ensuite, injectez le volume de L-DOPA avec la main dominante dans l’espace sous-cutané entre/sous les doigts, en gardant l’aiguille aussi parallèle que possible au corps pour éviter l’injection intramusculaire.
note: Les rats ne sont pas anesthésiés avant l’injection.
- Jetez chaque seringue usagée dans un récipient tranchant.
- Replacez le rat dans sa cage individuelle et ajoutez des friandises complètes sur le plan nutritionnel, sauf les jours d’évaluation de l’ILD, afin d’éviter d’interférer avec les évaluations comportementales jusqu’à ce que les évaluations soient terminées.
- Réglez la minuterie sur 1 à 2 minutes en fonction de la durée d’évaluation souhaitée et du nombre de rats dans l’étude les jours d’évaluation. Récupérez la cage suivante et injectez le rat suivant lorsque la minuterie l’indique.
- Répétez cette opération, en injectant un rat toutes les 1 à 2 minutes, jusqu’à ce que tous les rats soient injectés.
- Taux de dyskinésie induite par la lévodopa après l’injection
- Évaluez l’intensité (tableau 1) et la fréquence (tableau 2) des mouvements de dyskinésie dystonique et hyperkinétique au nombre de points temporels souhaité, qui devrait inclure le début du comportement de la LID, le comportement maximal et la phase de déclin.
- Pour les rats adultes mâles et femelles Sprague Dawley ou Fisher 344, et un échantillon de N = 40 rats, commencer les évaluations de dyskinésie 20 minutes après la première injection de L-DOPA, puis à intervalles de 50 minutes jusqu’à 220 ou 270 minutes après l’injection, selon le moment où les comportements de la LID ont cessé chez 90 à 100 % des rats.
- Si vous utilisez des intervalles d’évaluation de 1 minute, réglez une minuterie sur 1 min. Évaluez le premier rat sur une minute. Passez au rat suivant et notez-le pendant 1 min. Continuez à travers tous les rats, en les notant à des intervalles de 1 minute.
- Placez une minuterie à côté de la cage de manière visible afin que l’intensité du comportement de l’LID (tableau 1) puisse être observée tout en estimant la fréquence d’un comportement donné (tableau 2) pendant la période d’évaluation.
- Une fois que les cotes du premier point temporel sont terminées, commencez à nouveau avec le premier rat au point temporel suivant (p. ex., 70 minutes après l’injection) et continuez à l’intervalle souhaité (p. ex., toutes les 50 min) jusqu’à ce que tous les points temporels soient terminés.
note: En raison du chevauchement des tâches d’injection de L-DOPA et d’évaluation LID, deux personnes sont nécessaires les jours d’évaluation, une pour l’injection et une pour les évaluations comportementales.
