Détection du vieillissement neuronal dans une section organoïde corticale

Résumé

Source : Shaker, M. R., et al. Génération robuste et hautement reproductible d’organoïdes cérébraux corticaux pour la modélisation de la sénescence neuronale cérébrale in vitro. J. Vis. Exp. (2022).

Cette vidéo démontre la méthode de détection des neurones vieillissants dans les coupes organoïdes corticales par coloration pour l’activité de la bêta-galactosidase, qui est élevée dans les cellules sénescentes. L’enzyme clive un substrat pour produire un produit bleu, suivi d’une observation microscopique des neurones colorés.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.

1. Caractérisation du vieillissement neuronal chez les organoïdes corticaux

1. Organoïdes corticaux de processus pour les cryosections :
   REMARQUE : Les étapes ont été effectuées dans une cagoule de biosécurité de classe 2.
   1. Préparez des tubes de 2 ml remplis chacun de 1,5 ml de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %.
   2. Coupez l’extrémité d’une pointe de pipette P1000 (pour en faire un tube large) et transférez doucement chaque organoïde dans l’un des tubes de 2 ml préparés ci-dessus (un organoïde par tube).
      REMARQUE : Pour éviter que l’excès de milieu de différenciation (DM) ne se mélange avec le PFA, laissez l’organoïde s’enfoncer vers l’ouverture de la pointe de la pipette P1000 et posez la pointe juste au-dessus du haut du PFA dans le tube avant de pipeter l’organoïde. Cela permettra au chercheur de transférer uniquement l’organoïde et un milieu très minimal.
   3. Laisser le processus de fixation se dérouler à 4°C pendant 1 h.
   4. À l’aide d’une pointe de pipette P1000 non coupée, aspirez soigneusement l’excès de PFA et ajoutez 1,5 ml de solution saline froide 1x PBS (tamponnée au phosphate).
   5. Transférez les tubes dans un agitateur orbital réglé à 70 tr/min pendant 10 min à température ambiante (RT).
   6. Répétez le processus de lavage avec du PBS froid 1x trois fois pour vous assurer que tout le PFA a été complètement éliminé.
      REMARQUE : Ne jetez pas le PFA dans des conteneurs à déchets ordinaires ; au lieu de cela, préparez un conteneur d’élimination des déchets chimiques spécifique pour cela, car le PFA est un danger.
   7. Plongez les organoïdes dans 1x PBS contenant 30 % de saccharose et incubez à 4 °C jusqu’à ce que tous les organoïdes aient coulé au fond du tube.
      NOTE : Le temps nécessaire aux organoïdes pour couler dépend de leur taille et de leur âge. Les organoïdes de trois mois peuvent prendre jusqu’à 5 h.
   8. À l’aide d’une pointe de pipette P1000 coupée et à large alésage, transférez doucement trois à cinq organoïdes dans un moule de montage contenant une solution d’enrobage composée de 30 % de saccharose et de 100 % de milieu à température de coupe optimale (OCT) dans un rapport de 3:2.
   9. À l’aide d’une pointe de pipette de 10 μL à l’aide d’un stéréomicroscope, vous orientez et positionnez les organoïdes selon un motif en forme de grille.
   10. Placez le moule sur de la glace carbonique pour solidifier la solution OCT de saccharose avant de procéder à la cryo-sectionnement (16-20 μm) à l’aide d’un cryostat.
       REMARQUE : Pour la bêta-galactosidase associée à la sénescence, tous les tissus doivent être traités pour la coupe une fois qu’ils ont coulé. Pour l’immunofluorescence, les tissus peuvent être traités pour la section le lendemain. Si elles ne sont pas colorées immédiatement, toutes les lames contenant des coupes doivent être stockées à -20 °C avant l’immunofluorescence ou la bêta-galactosidase.
2. Processus d’analyse de la sénescence dans les organoïdes du cerveau cortical :
   REMARQUE : Les étapes suivantes peuvent être effectuées sur une paillasse de laboratoire normale.
   1. Transférez les lames dans un récipient de coloration de lames de microscope avec un couvercle et lavez le tissu organoïde sectionné trois fois avec 1x PBS pendant 10 minutes à RT pour éliminer tout excès de solution de montage.
   2. Ensuite, incubez le tissu lavé avec une solution de coloration à la bêta-galactosidase fraîchement préparée pendant la nuit à 37 °C.
      REMARQUE : La solution de coloration à la bêta-galactosidase est constituée d’un tampon phosphate (pour 10 mL de tampon phosphate : 8,15 mL de 1 M de NaH₂PO₄, 1,85 mL de 1M Na₂HPO₄) pH ajusté = 6, 100 mM d’hexacyanoferrate de potassium (III), 100 mM d’hexacyanoferrate de potassium (II) trihydraté, 5 M de NaCl, 1 M de MgCl₂, 20 mg/mL de X-Gal. Évitez d’utiliser un incubateur de culture cellulaire standard contenant du CO₂ car le CO₂ modifiera le pH de la solution de coloration à la bêta-galactosidase.
   3. Pour éliminer la solution de bêta-galactosidase, lavez les tissus colorés avec 1x PBS trois fois pendant 10 min chacune à RT.
   4. Montez les mouchoirs lavés avec un agent de montage anti-décoloration en verre et laissez la solution de montage se solidifier pendant 30 minutes à RT avant de l’observer au microscope.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
16 % de formaldéhyde (p/v) sans méthanol	Thermo Fisher Scientific	28908	4 % des PFA sont dilués dans 1x PBS
Microscope CKX53 avec caméra SC50	Olympe
Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco	Sigma Aldrich Pty Ltd	D1408-500ML
Milieu neurobasal	Thermo Fisher Scientific	21103049	Utilisé dans les médias DM
Composé d’enrobage OCT Sakura Clear (118 mL/bouteille)	Tissu Tek	4583
Hexacyanoferrate de potassium (II) trihydraté	Sigma Aldrich Pty Ltd	CP1087
Hexacyanoferrate de potassium(III)	Sigma Aldrich Pty Ltd	455946
Prolonge Verre Antifade Mountant	Life Technologies Australia (TFS)	Réf. P36980
Saccharose	Sigma Aldrich Pty Ltd	PHR1001-1G	30 % du saccharose sont dilués dans 1x PBS