Article de méthode

Convulsions induites par la manipulation dans un modèle murin

8 juillet 2025

Dans cet article

Résumé

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Source : Batot, G., et al. Un modèle d'épilepsie d'étiologie infectieuse à l'aide du virus de l'encéphalomyélite murine de Theiler. J. Vis. Exp. (2022).

Cette vidéo montre l'induction de convulsions induites par la manipulation chez une souris infectée par le virus de l'encéphalomyélite murine de Theiler (TMEV). La souris infectée, qui a des neurones hyperexcitables, est exposée à des stimuli physiques externes. Cette exposition provoque du stress, entraînant une activité électrique anormale dans les neurones, ce qui entraîne des convulsions.

Protocole

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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Inoculation du virus

  1. Stérilisation de la seringue d’injection
    1. Retirez le capuchon de la seringue à insuline. Ajoutez un tube en polyéthylène sous forme de collier autour de l’aiguille pour assurer une profondeur d’injection adéquate de 2,5 mm. Immergez la seringue dans l’éthanol pendant 30 min. Placez la seringue sous la lumière UV pendant 30 min.
    2. Remettez le capuchon sur l’aiguille. Enveloppez la seringue dans un sachet stérilisant et fermez-la avec du ruban adhésif. Étiquetez avec la date de préparation.
  2. Injection de virus
    1. Obtenez des aliquotes de la souche de TMEV de Daniel dans le congélateur à -80 °C. Décongelez le virus et gardez-le sur la glace. Évitez de décongeler et de recongeler le virus. Chargez la seringue avec la suspension virale (3 x 105 unité de formation de plaque [PFU] diluée dans 20 μL de solution saline tamponnée au phosphate [PBS] ou de milieu de culture Eagle modifié de Dulbecco [DMEM]).
      ATTENTION : Le virus est infectieux pour les souris mais pas pour les humains.
    2. Nettoyez le banc avec un désinfectant et passez sous un absorbeur de fumées. L’inoculation du virus n’est pas stérile mais est aussi propre que possible.
    3. Transférez la souris dans la chambre d’induction de l’anesthésie et utilisez de l’isoflurane à 2 % dans l’oxygène pour induire l’anesthésie. L’atteinte de la tolérance chirurgicale prend quelques minutes ; Ajustez la concentration en fonction de la respiration de l'animal et de la profondeur de l'anesthésie.
    4. Transférez la souris anesthésiée de la boîte d’anesthésie sous le capot. Vérifiez la tolérance chirurgicale, par exemple par pincement des orteils. L’ensemble de la procédure est effectué en moins de 30 s, de sorte que l’animal n’a pas besoin d’inhaler de l’isoflurane pendant l’injection. Ajoutez une pommade pour les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée.
    5. Nettoyez la tête de l’animal avec un tampon imbibé d’alcool. Inclinez légèrement la tête de la souris vers la gauche de manière à ce que le site d'injection soit dirigé vers le haut.
    6. Tirez un peu la peau vers l’arrière, insérez l’aiguille dans la tête et injectez 20 μL par voie intracorticale à une profondeur de 2,5 mm dans la région temporale de l’hémisphère droit (postérieure et médiale à l’œil droit).
    7. Effectuer l’injection unilatéralement dans le même hémisphère chez tous les animaux. Utilisez l’œil et l’oreille comme repères pour l’emplacement du cortex pariétal. L’emplacement a été préalablement vérifié histologiquement ; voir Figure 1. Les coordonnées d’injection selon l’injection stéréotaxique par rapport au bregma sont de −2,0 (AP) ; +3,0 (ML) ; −1,5 (VQ).
    8. Laissez la seringue en place pendant 5 à 15 secondes. Notez s’il y a une fuite d’injection ou si des bulles d’air sont observées - dans ce cas, préparez une nouvelle seringue. Lorsque vous retirez délicatement la seringue, tournez-la légèrement. Appliquez une pommade oculaire pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
    9. FACULTATIF : Coder l’animal sur la queue ou l’oreille selon les procédures locales (facultatif mais facile car l’animal est inconscient).
    10. Transférez l’animal dans une nouvelle cage, qui est placée à moitié sur / à moitié sur un coussin chauffant (35-40 °C) pendant la récupération de l’anesthésie. Ne laissez pas les animaux sans surveillance jusqu’à ce qu’ils aient repris une conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternal.
      NOTE : Les animaux peuvent être à nouveau hébergés en groupe après leur rétablissement (les animaux infectés ne sont pas mélangés avec des animaux faussement infectés). Les souris infectées ne doivent pas être logées dans la même pièce que les souris non infectées.
    11. Gardez une trace du poids des souris pendant les 7 premiers jours suivant l’infection, car elles perdent du poids après l’infection et peuvent nécessiter une alimentation supplémentaire.

2. Surveillance des crises provoquées par la manipulation

  1. Effectuez cette procédure par un expérimentateur aveugle au traitement. Apportez toutes les cages sur le banc. Observez les animaux pour les crises 2 fois par jour pendant la phase de lumière.
  2. Noter l’activité convulsive à l’aide d’une échelle de Racine modifiée : 0 = aucun changement de comportement, 1 = mouvements de la bouche et du visage, 2 = hochement de tête, 3 = clonus unilatéral des membres antérieurs, 4 = clonus bilatéral des membres antérieurs avec cabrage, 5 = activité tonico-clonique généralisée avec perte de tonus postural, parfois sauts, 6 = sauts prolongés et excessifs et hyperactivité. Signalez le nombre et l’intensité des crises.
  3. Faites glisser un stylo sur la cage pour faire du bruit.
  4. Transférez chaque animal dans une autre boîte et inversement.
  5. Secouez doucement la cage en effectuant un mouvement de va-et-vient, en prenant soin de ne pas secouer la cage si vigoureusement que les animaux heurteront les côtés ou le haut de la cage et risquent de subir des blessures physiques.
  6. Surveillez tous les animaux dans la cage pour détecter les saisies. À tout moment, si une souris a une crise, transférez-la dans la cage de la maison et notez le niveau de la crise sans autre stimulation de la crise par le bruit ou la manipulation.
  7. Pour les animaux qui n’ont pas saisi spontanément ou après avoir secoué doucement la cage, déclenchez des crises par une manipulation plus intense : Retournez délicatement la souris en la retournant sur sa queue de gauche à droite.
    NOTE : Les animaux souffrant de convulsions sont hyperexcitables et peuvent être nerveux.
  8. Observez à nouveau chaque animal pour détecter le comportement des crises. Répétez le processus pour les cages suivantes.

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Résultats

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figure-results-1
Figure 1 : Schéma de la procédure d’injection de TMEV. De gauche à droite : Pour une injection dans le cortex pariétal droit, l’aiguille est injectée légèrement latéralement d’une ligne imaginaire entre l’œil et l’oreille opposée. Le collier pour le contrôle de la profondeur est indiqué en jaune. Le tractus d’injection peut être vu dans la section coronale du cerveau, marquée par la flèche. Le site d...

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Équilibre animalOhaus (Parsippany, New Jersey, États-Unis)STX22020,01 g à 2200 g
Seringues à insuline BD Lo-Dose U-100BD (Mississauga, ON, Canada) BD329461Seringues stériles Lo-Dose avec aiguille IV permanente BD Micro-Fine - 1 mL
Souche de Daniel de TMEVaimablement fourni par Robert Fujinami (Université de l’Utah)-3 x 105 unités de formation de plaque aliquote(s)
Désinfectant, par exemple VennoVet 1 superMenno Chemie Vertriebsgesellschaft GmbH, Allemagne-Recommandé par les vétérinaires du campus avec moins de 5 % d’alcool
Fisherbrand medium stérile Tampon de préparation à l’alcool C7 Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, États-Unis)22-363-750
FlurisoVETone (Boise, ID, U.S.A)502017Isoflurane 250 mL, 2 % à 5 %
Absorbeur de fumées Labconco (Kansas City, Missouri, États-Unis)--
Protection générale jetable SMS blouses blanches Thermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, États-Unis)17-100-810A
Seau à glace--n’importe lequel
Cage à souris--toute cage à souris contenant au moins 5 souris
Aiguilles PrecisionGlide BD (Mississauga, ON, Canada)329652Seringues à insuline à aiguille BD Slip avec aiguille PrecisionGlide - 26 g x 3/8 - 0,45 mm x 10 mm
Sachet stérilisant auto-obturant Fisher Scientific (Hampton, État de New York, États-Unis)NC9241087 12,6 x 25,5 cm
Petit flacon en verre--tout, volume 25 mL
stérile PBSThermo Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, États-Unis)10010056
Seringue Luer-LokBD (Mississauga, ON, Canada)309628Seringue de 1 ml seulement
Nettoyeur à ultrasons, chauffage/minuterie mécaniqueCole-Parmer (Vernon Hills, Illinois, États-Unis)EW-08895-23Sonicateur de bain - 0,5 gal, 115 V

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Mots-clés

Virus de l enc phalomy lite murine de Theilerneurones hyperexcitablescytokines pro inflammatoireslib ration d hormones du stresschelle de Racine modifi escore de l activit pileptiquestimuli physiques externeshyperexcitabilit neuronale

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