Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation de la solution de lysophosphatidylcholine (LPC)
- Dissoudre 25 mg de poudre de LPC (voir le tableau des matériaux) avec 250 μL de solution mixte de chloroforme et de méthanol (1:1) pour obtenir une solution de LPC à 10 % et la transférer dans un tube à centrifuger de 500 μL.
REMARQUE : Si le LPC n’est pas complètement dissous, placez le tube de centrifugation dans un nettoyeur à ultrasons et ultrasonisez à 40 kHz pendant ~1 h pour obtenir une solution uniforme.
- Diviser la solution dans 3 μL/tube et la conserver à −80 °C.
REMARQUE : La solution peut être conservée pendant ~2 ans.
- Avant l’intervention, diluer la solution (étape 1.2) avec 27 μL de solution de chlorure de sodium (NaCl) à 0,9 % et maintenir la solution dans un bain-marie à température constante à 37 °C
REMARQUE : Préparez la solution juste avant de commencer l’injection.
2. Préparation chirurgicale
- Utilisez une aiguille de 32 G de 2 pouces pour la connecter à une seringue de 5 μL (voir le tableau des matériaux). Assurez-vous que la seringue d’un microlitre n’est pas obstruée. Prélever 5 μL de solution de LPC pour préparer l’injection.
- Anesthésie la souris dans une chambre d’induction reliée à un vaporisateur d’isoflurane avec 3 % d’isoflurane mélangé à 100 % d’oxygène à un débit d’environ 0,3 L/min.
- Confirmez la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réflexe de pincement des orteils pendant que la respiration est douce.
- Rasez la tête de la souris entre les oreilles à l’aide d’un rasoir électrique. Appliquez des gouttes oculaires lubrifiantes pour prévenir la sécheresse cornéenne pendant la procédure.
- Ensuite, positionnez la souris dans un cadre stéréotaxique (voir le tableau des matériaux) avec le côté dorsal vers le haut, et fixez la tête avec un cône nasal et une pince dentaire. Maintenir l’anesthésie avec 1,2 % à 1,6 % d’isoflurane par le nez.
note: La concentration d’isoflurane peut être ajustée en fonction de l’état respiratoire des souris.
3. Intervention chirurgicale
REMARQUE : Les animaux sont placés sur un coussin chauffant pendant toutes les procédures.
- Fixez la souris à l’appareil stéréotaxique avec des barres d’oreille bilatérales. Assurez-vous que les barres d’oreille sont de niveau et que la tête est horizontale et stable.
- Désinfectez la peau de la tête en l’essuyant plusieurs fois avec de l’iodophore, puis de l’alcool dans un mouvement circulaire. Ensuite, un scalpel est utilisé pour découper une petite incision d’environ 1,5 cm le long de la ligne médiane du cuir chevelu afin d’exposer le crâne.
- Essuyez le crâne avec un coton-tige trempé dans du peroxyde d’hydrogène à 1 % jusqu’à ce que la bregma, la lambda et la fontanelle postérieure soient exposées. Placez la seringue sur l’appareil stéréotaxique.
REMARQUE : Utilisez le peroxyde d’hydrogène avec précaution et évitez de toucher les tissus environnants.
- Assurer le positionnement horizontal de la tête de l'animal (à l'avant et à l'arrière et à gauche et à droite).
- Ajustez le bouton de l’axe Z du cadre stéréotaxique de manière à ce que la pointe de l’aiguille et le crâne se touchent sans se plier, puis mesurez les coordonnées de l’axe Z. Vérifiez les coordonnées Z de la bregma et de la fontanelle postérieure.
- Ajustez la barre d’oreille de manière à ce que la différence entre les coordonnées Z de la bregma et de la fontanelle postérieure ne dépasse pas 0,02 mm. Ensuite, suivez la même méthode pour mesurer les coordonnées Z des positions correspondantes sur les côtés gauche et droit de la ligne médiane. Ajustez la barre d’oreille pour vous assurer que la gauche et la droite sont au même niveau.
- Localisez le corps calleux. Définissez l’origine XYZ sur bregma.
REMARQUE : Le premier site d’injection est de 1,0 mm sur le côté de la bregma, de 2,4 mm de profondeur et de 1,1 mm en avant. Le deuxième site d’injection est de 1,0 mm latéral au bregma, de 2,1 mm de profondeur et de 0,6 mm antérieur. Par exemple, la coordonnée du bregma est (0,0,0). Mesurez la coordonnée Z de l’emplacement correspondant marqué (-1, 1.1, X) et (-1, 0.6, Y). On peut déterminer que la première coordonnée du site d’injection du corps calleux est (-1, 1,1, −[X + 2,4]) et que la deuxième coordonnée du site d’injection est (-1, 0,6, −[Y + 2,1]).
- Une fois le site d’injection déterminé, faites une marque avec un marqueur stérile sur le crâne et notez les coordonnées.
- Percez doucement l’endroit marqué à l’aide d’une perceuse à crâne (voir tableau des matériaux). Prenez soin d’éviter tout saignement.
- Déplacez lentement l’aiguille aux coordonnées indiquées et commencez l’injection. Pour induire la démyélinisation du corps calleux, injecter 2 μL de solution LPC (étape 1.2) à chaque point d’injection (étape 3.5) à un débit de 0,4 μL/min.
- Après l’injection, garder l’aiguille à chaque endroit pendant 10 min.
supplémentaires
REMARQUE : Assurez-vous que l’intervalle de deux injections ne dépasse pas 20 minutes.
- Suturez la peau avec une suture 4-0 et attendez que l’animal se réveille dans les 10 minutes. Administrez des analgésiques en postopératoire conformément à la réglementation institutionnelle sur les soins aux animaux.
REMARQUE : Le temps recommandé pour l’euthanasie peut être déterminé en fonction du but de l’expérience.