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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des solutions d’hémoglobine et de LCR
- Préparez une solution stérile de liquide céphalorachidien artificiel (LCRa) en ajoutant 500 μL de la solution de LCa dans un microtube de 1,5 mL et conservez-la sur de la glace.
- Préparez une solution d’hémoglobine stérile à 150 mg/mL en ajoutant 75 mg d’hémoglobine à 500 μL d’aCSF dans un microtube de 1,5 mL et conservez-la sur de la glace.
2. Préparation de l’animal pour l’injection
- Tournez le coussin chauffant sur le réglage moyen pour maintenir la température corporelle du rat.
- Anesthésier les rats du jour 4 postnatal (P4) dans une chambre d’induction remplie d’isoflurane à 3 %.
note: Confirmez une anesthésie suffisante en utilisant la réponse par pincement des orteils/de la queue toutes les 15 minutes. Surveillez l’anesthésie avec une observation visuelle de la couleur des tissus, de la température corporelle et de la fréquence respiratoire.
- Administrer un soulagement de la douleur avec une injection sous-cutanée de 5 mg/kg de carprofène au rat anesthésié.
- Placez le rat anesthésié couché dans l’appareil stéréotaxique avec le nez positionné dans l’adaptateur d’anesthésie avec un débit constant de 1,5 % d’isoflurane.
- Serrez les barres d’oreille non rompues sur le méat auditif externe pour sécuriser la tête.
note: Appliquez une pommade vétérinaire pour garder les yeux hydratés si les yeux sont ouverts au moment de l’injection.
- Nettoyez la tête en alternant avec des applicateurs stériles à embout de coton imbibés de bétadine et d’éthanol à 70 %.
- Touchez l’applicateur imbibé de bétadine au centre du cuir chevelu et étalez la bétadine en cercles, en vous déplaçant vers l’extérieur.
- Répétez l’étape 2.6.1.1 avec l’applicateur imbibé d’éthanol.
- Répétez l’étape 2.6.1.1 et l’étape 2.6.1.2 3 fois.
- Appliquez un champ chirurgical stérile pour protéger le champ opératoire.
- À l’aide d’un scalpel stérile, faites une incision verticale de 0,3 cm au centre de la tête pour exposer le bregma du crâne.
note: Si vous injectez à partir du lambda, exposez le lambda du crâne au lieu du bregma.
- Utilisez un applicateur stérile à embout de coton pour sécher la zone.
3. Mise en place de l’injecteur stéréotaxique
- Prélevez la solution d’hémoglobine préparée à l’étape 1.2 dans une seringue stérile de 0,3 mL à l’aide d’une aiguille de 30 G et placez la seringue dans le système d’injection stéréotaxique.
note: Si des conditions de contrôle sont générées, prélever une solution de LCR préparée à l’étape 1.1 dans une seringue stérile de 0,3 mL et appliquer le protocole.
- Allumez l’interface de l’injecteur stéréotaxique et cliquez sur le bouton Configuration pour saisir les paramètres de volume et de débit d’injection.
- Cliquez sur Volume et réglez le volume sur 20 000 nL (20 μL).
- Cliquez sur Taux d’infusion et réglez le débit à 8 000 nL/min (8 μL/min).
- Quittez la configuration en cliquant sur le bouton Réinitialiser le point de vente.
- Rincez la pointe de l’aiguille en cliquant sur le bouton Infuser jusqu’à ce qu’une petite perle de solution d’hémoglobine émerge à la pointe de l’aiguille.
- Évacuez doucement la solution d’hémoglobine de l’extrémité de l’aiguille à l’aide d’un applicateur stérile à bout de coton.
4. Injection animale
- Réglez le bregma à zéro sur le système d’injection stéréotaxique en ajustant les positions médiolatérale et antéropostérieure de la seringue avant d’abaisser l’extrémité de l’aiguille de la seringue rincée pour toucher doucement le crâne au niveau du bregma.
note: Si vous injectez à partir de la fonction lambda, définissez la valeur zéro pour lambda.
- Identifiez les coordonnées de votre choix.
- Si l’injection à partir du bregma, chez les rats P4 décrits ici, utilisez 1,5 mm latéral, 0,4 mm antérieur et 2,0 mm de profondeur à partir du bregma.
- Si vous injectez à partir du lambda, utilisez les coordonnées suivantes pour les rats P4 : 1,1 mm latéral, 4,6 mm antérieur et 3,3 mm de profondeur à partir du lambda.
- Soulevez l’aiguille de la seringue à 1 cm au-dessus du crâne pour dégager le cuir chevelu. Lorsque la seringue est levée, procédez au réglage des coordonnées médiolatérales et antéropostérieures.
- Abaissez l’aiguille de la seringue pour toucher doucement le crâne. Vérifiez que l’aiguille touche le crâne.
- Définir la coordonnée dorso-ventrale sur une période de 30 s.
note: Lors de la définition de la coordonnée dorso-ventrale, l’aiguille va perforer le crâne. Il faut veiller à ce que la seringue traverse le crâne sans déformer le crâne. La déformation du crâne est évitée en retirant lentement l’aiguille le long de la coordonnée dorso-ventrale si une déformation se produit, puis en replaçant l’aiguille le long de la même trajectoire. Cela permet à l’aiguille de passer à travers le trou du crâne avec moins de force et sans déformation.
- Sur l’interface de l’injecteur stéréotaxique, cliquez sur le bouton Exécuter pour commencer l’injection.
- Une fois l’injection terminée, laissez l’aiguille de la seringue en place pendant 2 minutes pour minimiser le reflux de la solution.
- Retirez lentement la seringue le long de la coordonnée dorso-ventrale pendant 2 minutes jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille soit à 2 cm au-dessus du cuir chevelu.
- Faites pivoter le bras de l’injecteur stéréotaxique en l’éloignant du champ opératoire.
5. Soins postopératoires
- Fermez le cuir chevelu avec une suture monofilament 6-0. Faites une simple suture interrompue au centre de l’incision de 0,3 cm.
- Retirez le chiot de l’anesthésie et placez-le sur un endroit sûr du coussin chauffant.
- Retournez le rongeur dans la cage d’origine pour qu’il se remette de l’anesthésie sous la garde de sa mère.
note: Le retour en temps opportun aux soins de la mère réduit la mortalité postopératoire précoce.
- Surveiller les animaux pour une anesthésie par perte du réflexe de redressement toutes les heures après l’opération pendant 3 h.
- Surveillez les animaux quotidiennement pendant 7 jours pour une activité normale, un apport alimentaire et une prise de poids. Surveillez le site d’incision pour détecter la cicatrisation, la fermeture et la réapparition de la fourrure au site de la chirurgie.
note: Dans les rares cas où des changements neurologiques tels que des convulsions, une dépression centrale ou une diminution de l’appétit sont observés pendant la surveillance, euthanasier l’animal par perfusion intravasculaire ou luxation cervicale sous anesthésie.
- Pour prévenir l’infection une fois que la suture est fermée et que la plaie cicatrise, appliquez un triple antibiotique topique au site d’incision.