Déclenchement et surveillance des crises induites par la chaleur dans un modèle de souris transgénique

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation pour le test de saisie induite par la chaleur

1. Activez le bouton de mise sous tension de la chambre de chauffage, puis le bouton de mise en marche.
2. Réglez la température de la chambre thermique à 50 °C à l’aide du clavier du régulateur de température numérique.
3. Attendez au moins 1 h pour préchauffer la chambre à 50 °C avant d’introduire la première souris dans la chambre. Le préchauffage assure un chauffage uniforme à l’intérieur de la chambre.
4. Tapissez le sol de la chambre de chaleur de la souris avec de la litière en épis.
5. Installez une caméra d’enregistrement vidéo devant la chambre thermique pour enregistrer chaque essai de test de crise induite par la chaleur.
6. Tapisser une boîte de Pétri de 140 mm de diamètre avec d’épaisses couches de papier de soie et la placer sur de la glace pour servir de coussin rafraîchissant.
   note: À la fin de l’essai, les souris individuelles seront transférées dans le coussin de refroidissement pré-refroidi pour aider à réduire leur température corporelle élevée.

2. Préparation de la souris pour le test de crise induite par la chaleur

1. Sélectionnez 10 souris adultes (P30-P40), 5 porteuses de la mutation causant l’épilepsie et 5 des compagnons de portée de type sauvage pour un test de dépistage des crises induites par la chaleur.
   note: Les souris de type sauvage, qui n’hébergent aucune mutation causant l’épilepsie, ne présentent pas de convulsions induites par la chaleur à des températures inférieures à 44 °C et servent de groupe témoin.
2. Pesez chaque souris qui sera utilisée pour l’essai de dépistage et notez son poids corporel. Seules des souris pesant 15 g ou plus doivent être utilisées pour le test.
3. Examinez une souris à la fois dans la chambre de chauffe de la souris.
4. Anesthésier brièvement la souris pendant 10 à 15 s à l’aide de quelques gouttes d’isoflurane au fond d’une cloche.
5. Sortez l’animal de la cloche et placez-le sur une serviette en papier.
6. Assurez-vous que la souris est complètement anesthésiée en vérifiant qu’elle ne répond pas à un pincement nocif de l’orteil.
7. Enduisez l’extrémité métallique de la sonde de température rectale d’un lubrifiant (tel que de la vaseline) et insérez-la doucement dans la souris à une profondeur inférieure ou égale à 2 cm.
8. Fixez la sonde rectale à la queue de la souris avec du ruban adhésif afin que la sonde ne sorte pas pendant le test.
   note: Vous pouvez également placer l’animal dans un cône de contention de souris et insérer la sonde de température rectale. Fixez-le en le collant à la queue.
9. Assurez-vous que la sonde rectale est connectée à un multimètre qui affiche la température corporelle interne de la souris.
10. Placez l’animal dans une cage fraîche doublée d’une litière d’épis, c’est-à-dire la cage de récupération.
11. Démarrez une minuterie et attendez 5 min. Observez la souris jusqu’à ce qu’elle soit complètement rétablie de l’anesthésie et qu’elle soit active et toilette.
    1. Simultanément, surveillez la température corporelle centrale de la souris jusqu’à ce qu’elle se stabilise à 35-36 °C.
12. Au bout de 5 min, notez la température corporelle de la souris. Il s’agit de la température corporelle initiale à l’instant « 0 » min.
    note: Si la température corporelle centrale de la souris est inférieure à 35 °C, attendez plus de temps pour que l’animal se remette de l’hypothermie induite par l’anesthésie.
13. Transférez rapidement la souris individuelle dans la chambre de souris préchauffée. Cela marque le DÉBUT de l’essai expérimental. Une seule souris est filtrée à la fois.

3. Essai de crise induite par la chaleur

1. Après avoir délicatement placé la souris sur le sol de la chambre de chaleur de souris préchauffée, fermez la porte en plexiglas et démarrez la caméra pour l’enregistrement vidéo de l’expérience.
2. Démarrez le chronomètre. Enregistrez la température corporelle de la souris à partir du thermomètre rectal à des intervalles de 1 minute pendant toute la durée de l’expérience.
3. À intervalles réguliers, augmentez la température de la chambre de chaleur de la souris de sorte que la température corporelle de la souris augmente à un taux de 0,25 à 0,5 °C /min
   note: L’augmentation rapide de la température corporelle peut entraîner un coup de chaleur ou la mort et doit être évitée.
4. En suivant ce protocole, augmentez la température de la chambre de chaleur de la souris de 5 °C toutes les 10 minutes, comme illustré à la Figure 1A.
5. À 9,5 min, réglez la température de la chambre chauffante sur 55 °C, pour stabiliser la température de la chambre chauffante à 55 °C à la 10e minute, comme indiqué sur l’affichage numérique de la température.
6. De même, augmentez la température à 60 °C à 19,5 min pour stabiliser la température de la chambre thermique à 60 °C à la 20e minute. Chaque essai de dépistage des crises dure 30 min.
7. Si la souris a une crise (vocalise, hoche la tête, clone des membres antérieurs, extension des membres postérieurs, tombe sur le côté ou subit des convulsions toniques/cloniques généralisées), notez les informations suivantes.
   1. Enregistrez la température corporelle de la souris pendant la crise (température seuil de la crise) à partir du thermomètre de température rectale.
   2. Notez les caractéristiques du comportement convulsif telles que le hochement de tête, le clonus des membres antérieurs, l’extension des membres postérieurs, la chute sur le côté et/ou les crises toniques/cloniques généralisées (GTCS) affichées par la souris.
8. Retirez rapidement mais doucement la souris de la chambre et placez-la sur le coussin de refroidissement préparé à l’étape 1.6.
   note: Si une souris a des convulsions sur l’échelle 5 de Racine et qu’elle saute de manière incontrôlée, il peut être difficile de retirer l’animal de la chambre chauffante et de le transférer dans le coussin de refroidissement à l’extérieur. Cependant, une crise typique induite par la chaleur dure entre 30 s et 60 s. Ainsi, la souris doit être sortie de la chambre thermique et placée sur le coussin de refroidissement dans les 60 s suivant le début de l’épisode de crise induite par la chaleur.
9. Attendez que la température corporelle de la souris descende à 36-37 °C avant de la transférer dans une cage de récupération. Une seule souris est placée dans une cage de récupération à la fois.
   note: Ne mélangez pas des souris qui n’ont pas encore été utilisées pour le dépistage induit par la chaleur avec la souris qui a déjà fait l’expérience de l’essai d’expérience sur les crises induites par la chaleur.
10. Doucement et soigneusement, coupez le ruban adhésif entre la queue de la souris et le fil de la sonde rectale avec une paire de ciseaux pour retirer la sonde rectale de la souris.
11. Essuyez l’extrémité métallique de la sonde rectale avec de l’alcool à 70 % et des lingettes pour tissus mous afin de la garder prête pour le prochain essai.
12. Continuez à observer la souris dans la cage de récupération jusqu’à ce qu’elle reprenne une activité normale (marche, toilettage, etc.), avant de remettre la souris dans sa cage d’origine. Cela marque la fin de l’essai expérimental pour cette souris.
13. Enregistrez le statut de l’animal après l’essai - vivant et récupéré de la session de test ou mort. Des crises de haute intensité impliquant des sauts incontrôlés et des crises toniques/cloniques généralisées peuvent parfois entraîner la mort de la souris.
14. Si une souris ne présente pas de convulsions induites par la chaleur pendant la période d’observation de 30 minutes ou si la température corporelle de la souris atteint 44 °C, retirez-la de la chambre thermique et placez-la sur le coussin de refroidissement jusqu’à ce que la température corporelle de la souris revienne à 36-37 °C.
15. Réinitialisez la température de la chambre de chauffe de la souris à 50 °C et laissez-la s’équilibrer jusqu’à ce que la température affichée sur le contrôleur de température numérique indique 50 °C.
16. Changez la litière de l’épi entre les essais individuels de souris.

Figure 1 : Les souris mutantes présentent des convulsions induites par la chaleur. (A) Le protocole de chauffage pour le dépistage comportemental des crises induites par la chaleur chez la souris. (B-C) Température corporelle moyenne des souris au fil du temps chez les souris de type sauvage (Scn1a+/+ - triangles noirs) et les souris mutantes hétérozygotes (Scn1aKT/+ - cercles orange) dans deux fonds génétiques 129X1 et B6N, respectivement. (D) Pourcentage de souris présentant des convulsions induites par la chaleur dans les deux contextes génétiques. Les souris de type sauvage (Scn1a+/+) et hétérozygotes (Scn1aKT/+) sont représentées par des barres noires et oranges, respectivement. Les mutants hétérozygotes dans les arrière-plans 129X1 et B6N sont représentés respectivement par des barres pleines orange et des barres orange avec des bandes noires. (E) Seuil de température convulsive pour les convulsions induites par la chaleur chez les souris de type sauvage (Scn1a+/+) et mutantes hétérozygotes (Scn1aKT/+) dans les deux souches. (F) Distribution de diffusion des scores maximaux de Racine des crises induites par la chaleur présentées par des souris hétérozygotes (Scn1aKT/+) dans les deux contextes génétiques. Chaque point représente le score maximal de Racine en une seule souris. Le nombre d’animaux dans chaque génotype est indiqué entre parenthèses. Les données présentées dans les panneaux B-F sont la moyenne ± la moyenne d’erreur type (S.E.M).