Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Coloration de l’anticorps primaire et de la biocytine
(Jour 1)
REMARQUE : La procédure d’immunocoloration suivante concerne les sections flottantes et nécessite une agitation continue à basse vitesse (2 tours/min, tr/min) sur un agitateur pour toutes les étapes d’incubation.
- Lavez le mouchoir 3 fois pendant 10 minutes chacune dans 0,1 M de PBS (pH = 7,4).
REMARQUE : Le PBS 0,1 M peut être acheté dans le commerce ou fabriqué en laboratoire comme suit (pour 1 L) : 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, et 0,24 g de KH2PO4 dans 1 L de dH2O.
REMARQUE : Si le marqueur neurochimique souhaité est connu, la coloration d’une protéine/peptide peut être effectuée en même temps que la coloration de la biocytine (étapes 1.2 - 1.4). Si la coloration ne concerne que la biocytine, passez à l’étape 1.5 de .
- FACULTATIF : Bloc avec 10 % de sérum bloquant (BS ; sérum de chèvre normal (NGS) dilué dans 0,3 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 1 h à RT).
REMARQUE : Chaque puits doit recevoir le même volume de solution ; le volume recommandé est compris entre 250 et 500 μL/puits. La sélection du sérum bloquant est basée sur l’espèce chez laquelle les anticorps secondaires sont élevés (e.g., NGS est utilisé pour les anti-(espèces d’anticorps primaires respectives)). S’il est nécessaire d’utiliser des anticorps secondaires élevés chez différentes espèces pour des coupes d’immunocoloration, inclure 10 % de chaque sérum normal dans l’étape de blocage (2) et 3 % de chaque sérum normal pour les étapes d’incubation des anticorps primaires et secondaires.
- (FACULTATIF) Incuber les sections dans l’anticorps primaire, CB1R (polyclonal, cobaye), avec 0,3 % de Triton X-100 et 3 % de BS dans 0,1 M PBS à RT O/N. CB1R est utilisé pour identifier l’expression du récepteur cannabinoïde de type 1.
REMARQUE : Cette étape est facultative et n’est pas nécessaire pour révéler le remplissage de la biocytine. La figure 2 illustre une section étiquetée pour la biocytine et le CB1R pendant le premier processus de coloration. L’incubation O/N à RT est suffisante pour la plupart des anticorps primaires ; cependant, certains anticorps primaires, y compris CB1R, nécessitent une incubation de 3 à 5 jours. Si l’incubation doit durer plus de 1 jour, il est recommandé d’incuber à 4 °C car le Triton X-100 peut perméabiliser les tranches et peut entraîner la désintégration du tissu lors d’une incubation prolongée à température ambiante. Inclure un témoin négatif dépourvu d’anticorps primaire dans au moins une section pour chaque série d’expériences afin de contrôler la spécificité de l’anticorps secondaire. Pour les témoins négatifs, l’anticorps primaire est omis, mais le Triton X-100 à 0,3 % dans 0,1 M PBS et BS est ajouté.
(Jour 2)
- Lavez les sections de cerveau 3 fois pendant 10 minutes chacune dans 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Incuber les sections dans un conjugué de colorant rouge streptavidine (concentration : 1:1 000 ; excitation : 594 nm avec émission dans le spectre rouge visible) avec 0,3 % de Triton X-100 et 3 % de BS dans 0,1 M PBS à 4 °C O/N dans l’obscurité (enveloppé dans une feuille d’aluminium) pour révéler la biocytine. FACULTATIF : Inclure un anticorps secondaire, chèvre anti-cobaye (concentration : 1:500 ; excitation : 488 nm et émission en vert), l’incubation ci-dessus suivant l’incubation primaire facultative à l’étape 1.3.
REMARQUE : Un anticorps secondaire ne sera nécessaire que si la coloration optionnelle des anticorps primaires (étape 1.3) est effectuée. Pour visualiser la biocytine, il est recommandé d’utiliser un conjugué streptavidine-fluorophore avec un spectre d’émission en rouge, car il permet de visualiser les axones plus fins en détail et avec un meilleur contraste (Figures 1 - 3).
(Jour 3)
- Lavez des sections de cerveau 3 fois pendant 10 minutes chacune dans 0,1 M PBS (pH = 7,4).
- Pour protéger la fluorescence et faciliter la recoloration à l’avenir, montez les sections dans un support de montage à base aqueuse et scellez les bords de la lamelle avec du vernis à ongles transparent.
REMARQUE : Il est préférable de reteindre les sections le plus tôt possible pour éviter les difficultés à retirer le vernis à ongles de la lame, l’infestation de moisissures et la déshydratation des tissus due à la fuite du support de montage de la lame de verre. La contamination microbienne peut être évitée en utilisant de l’azoture de sodium à 0,02 % dans le PBS.
ATTENTION : L’azoture de sodium est hautement toxique et inflammable lorsqu’il est en contact avec l’eau. Veuillez vous référer aux procédures opérationnelles standard pour la manipulation et l’élimination des produits chimiques dangereux.
(Jours 4 à 7)
- Effectuez une imagerie confocale avec excitation à 594 et 488 nm et à un grossissement de 20X ou 40X pour révéler les neurones remplis de biocytine en rouge et les marqueurs neurochimiques (CB1R) en vert. Évaluez le co-étiquetage (Figure 2).
- Réglez l’exposition de la caméra à moins de 100 ms pour éviter le photoblanchiment et obtenir des piles d’images confocales des arborescences axonales et dendritiques de l’ensemble du neurone. Utilisez des piles d’images confocales et des progiciels de traçage de neurones pour reconstruire la morphologie neuronale.
