1. Préparation des coupes de biopsies par aspiration rectale (RSB)
- Placez les biopsies d’aspiration rectale dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 6 h pour fixer le tissu. Utilisez un volume fixateur 5 fois supérieur au volume du tissu.
- Déshydrater les tissus à l’aide du déshydrateur de tissus pathologiques pendant 11 h. L’ensemble du processus programmé se compose des 5 étapes suivantes :
- Placez le mouchoir dans du formaldéhyde et fixez-le pendant 1 h.
- Placez le mouchoir dans de l’éthanol à 75 % pendant 4 h.
- Placez le tissu dans de l’éthanol absolu (deux changements, 1 h chacun).
- Placez le tissu dans de l’éthanol absolu (deux changements de 30 min chacun).
- Placez le mouchoir dans du xylène (trois changements, 1 h chacun).
- Placez le mouchoir dans de la cire de paraffine (58-60 °C) (trois changements, 1 h chacun). Intégrez les tissus RSB dans des blocs de paraffine.
- Coupez les blocs de paraffine à l’aide d’un microtome jusqu’à ce que le tissu soit entièrement exposé avec un plan de coupe complet.
- Coupez les blocs en sections de 0,4 μm avec un microtome.
- Placez les sections dans de l’eau à 45-50 °C pendant quelques secondes chacune pour permettre aux sections de s’étaler en une assiette plate.
- Transférez les sections de paraffine sur les lames.
- Faites cuire les lames dans un four à 60 °C pendant 3 à 5 h. Évitez de cuire trop longtemps, ce qui pourrait entraîner la perte d’antigènes.
- Placez les lames déparaffinisées dans du xylène (2 changements, 15 min chacun).
- Hydratez les lames avec de l’éthanol absolu, 95 %, 80 % et 75 % d’éthanol pendant 5 minutes chacune. Ensuite, rincez-les dans de l’eau purifiée par osmose inverse (OI) pendant encore 5 min.
2. Récupération de l’antigène
- Effectuer des dilutions de travail pour la récupération de la calrétinine en mélangeant 4 mL de tampon de récupération de l’antigène de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) avec 200 mL d’eau purifiée par osmose inverse. Effectuer des dilutions de travail pour la récupération du S100 et du produit génique protéique 9.5 (PGP9.5) en mélangeant 1 mL de tampon de citrate de sodium d’acide citrique (100x) avec 99 mL d’eau purifiée par osmose inverse.
REMARQUE : La calrétinine peut être récupérée de préférence par la solution de récupération EDTA. Cependant, le tampon de citrate de sodium d’acide citrique est plus adapté à la récupération de S100 et PGP9.5.
- Placez les lames dans un bocal de coloration coplin. Remplissez le bocal avec la solution de récupération et placez-le dans un bain-marie bouillant préchauffé. Après avoir fait bouillir pendant 20 min, retirez le pot du bain-marie et laissez-le refroidir à température ambiante. Le processus de refroidissement prend environ 10 min. Retirez les lames et rincez-les doucement une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
- Tracez un cercle avec un marqueur autour du mouchoir et préparez une boîte humide pour les procédures suivantes.
3. Blocage
- Faites des dilutions de travail en mélangeant 3 mL de 30 % H2O2 avec 27 mL d’eau purifiée RO.
- Déposez deux ou trois gouttes de solution à 3 % de H2O2 goutte à goutte sur le tissu pour bloquer les peroxydases. Ajouter rapidement la solution H2O2 pour s’assurer qu’elle ne déborde pas du cercle. Bloquer les peroxydases dans un incubateur à 37 °C pendant 20 min.
- Rincez doucement les lames avec du PBS (trois lavages de 5 min chacun).
- Bloquer les lames pendant 20 min à 37 °C avec de l’albumine sérique bovine à 5 % (BSA, préparée en mélangeant 1,5 g de poudre BSA avec 30 mL d’eau purifiée par osmose inverse).
REMARQUE : Le blocage avec 3 % de peroxyde d’hydrogène peut empêcher 95 % des taches non spécifiques et le blocage avec 5 % de BSA peut prévenir les 5 % restants des taches non spécifiques. Combinez les deux méthodes pour obtenir un résultat fiable.
4. Réaction antigène-anticorps
- Retirez la BSA à 5 % et ajoutez 50 μL d’anticorps primaires (calrétinine, S100 ou PGP9.5) sur la lame. Incuber toute la nuit à 4 °C.
- Lavez la lame avec du PBS (trois fois, 3 min chacune).
- Ajouter 50 μL d’exhausteur de polymère (réactif A ; voir tableau des matériaux) dans la section et l’incuber pendant 20 min dans un incubateur à 37 °C. Ensuite, lavez la lame avec du PBS (trois fois, 3 min chacune).
- Ajouter 50 μL d’anticorps secondaire B (anticorps secondaire IgG de chèvre et de souris) dans la section et incuber pendant 30 min dans un incubateur à 37 °C. Lavez la section avec du PBS (trois fois, 5 min chacune).
5. Coloration à la 3,3-diaminobenzidine et à l’hématoxyline
- Ajouter 850 μL d’eau purifiée par osmose inverse dans un tube de 1,5 mL et ajouter les réactifs de coloration (voir le tableau des matériaux) dans l’ordre A, B et C. Ajouter 50 μL de chaque réactif pour obtenir un total de 1 mL de solution de travail de 3,3-diaminobenzidine (DAB). S’il y a des précipités, utilisez la solution après filtration.
- Ajoutez une goutte de solution de travail DAB sur la section de tissu et colorez pendant 3 à 10 min. Incuber les lames dans du DAB à température ambiante jusqu’à ce qu’une coloration brune soit détectée. Surveillez attentivement à l’aide d’un microscope à fond clair. Conservez la solution de travail DAB à l’abri de la lumière. Ensuite, lavez la lame avec du PBS pendant 5 min.
- Ajoutez une goutte d’hématoxyline pour contre-colorer les noyaux pendant environ 1 min. Ensuite, tenez le pot de coplin et lavez-le sous un filet d’eau pendant environ 30 à 40 s jusqu’à ce que l’excès de colorant soit éliminé. Veillez à ne pas endommager les sections de tissus.
- Immergez les lames RSB dans un bocal coplin contenant du PBS pendant 25 à 30 s. Ensuite, dériver en acide chlorhydrique-éthanol à 1 % pendant 10 s. Lavez les lames avec du PBS pendant 1 min.
- Déshydratez les lames dans l’ordre inverse de l’hydratation : 75 %, 80 %, 95 % et de l’éthanol absolu (5 min chacune).
- Exposer les lames au xylène (2 changements de 5 min chacun).
- Montez la lamelle à l’aide d’un support ultraclean. Laissez sécher les lames avant de les visualiser à l’aide d’un microscope.