Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Préparation des solutions de dissection et du liquide céphalo-rachidien artificiel
- Eau ultra-pure de carbogénate (qui est de l’eau filtrée avec une résistivité de 18,2 MΩ·cm) avec du carbogène (95 % O2/5 % CO2) pendant 5 min à l’aide de diffuseurs à bulles de pierre à air (aérateurs pour aquariums).
note: Les pierres à air peuvent être connectées au régulateur du réservoir de carbogen via un tube en silicone standard. Si des pierres à air ne sont pas disponibles, fermez l’extrémité du tube en silicone et percez de petits trous dans le joint pour permettre au gaz carbogène de bouillonner et de carbogene la solution.
- Préparez une solution de dissection en dissolvant les solutés du tableau 1 dans de l’eau ultrapure. Ajoutez du CaCl2 à une solution qui a été carbogénée pendant au moins 5 min pour l’aider à se dissoudre.
note: Vous pouvez également ajouter d’abord du CaCl2, afin qu’il puisse se dissoudre facilement dans une solution insaturée. La solution, sous forme liquide, doit avoir une tension de 300 à 320 mOsm/L et un pH de 7,4 après avoir été saturée en carboving.
- Réfrigérez la solution de dissection à une température de 0 à 4 °C. Laissez la solution au réfrigérateur pendant la nuit ou placez-la au congélateur pendant 1 h et surveillez en permanence la température.
note: La solution de dissection peut être conservée jusqu’à 3 nuits ; jeter par la suite.
- Carbogéner la solution de dissection pendant 5 à 10 min avant utilisation.
note: Idéalement, la solution devrait soit apparaître sous forme de gadoue, soit passer à la gadoue avant d’être utilisée.
- Préparez le liquide céphalo-rachidien artificiel de rongeur (ACSF) en dissolvant les solutés du tableau 2 dans de l’eau ultrapure. Carbogénez la solution ACSF pendant qu’elle est dans un bain-marie chauffé à 35 °C jusqu’à utilisation. Ajoutez du CaCl2 à une solution qui a été carbogénée pendant au moins 5 min pour l’aider à se dissoudre.
note: Vous pouvez également ajouter d’abord du CaCl2 afin qu’il puisse se dissoudre plus facilement dans une solution insaturée. La solution, sous forme liquide, doit être de 290 à 320 mOsm/L et avoir un pH de 7,4 après avoir été saturée en carbogène. Les solutions doivent être réalisées dans des volumes de 1, 2 ou 4 L selon la durée des expériences. Faites 4 L pour une journée complète (8 h) d’expériences. L’ACSF doit être renouvelé chaque jour ; Ne le conservez pas plus de 1 jour.
2. Dissection de souris pour prélever du tissu cérébral
- Rassemblez tous les outils et le matériel nécessaires aux dissections d’animaux. Aménagez l’espace de travail pour préparer les dissections d’animaux.
- Vérifiez le réservoir de carbogen (95 % O2/5 % CO2) pour vous assurer qu’il n’est pas vide. Remplacez la bouteille de gaz avant les expériences s’il reste moins de 500 psi de pression.
- Calibrez le vibratome (trancheuse à tissu à lame vibrante) conformément au manuel d'instructions du fabricant. Ajustez le réglage du vibratome pour avoir une amplitude de coupe de 1 mm et une vitesse de coupe de 0,12 mm/s.
note: Les réglages optimaux peuvent différer pour chaque coupe-lame de tissu vibrant ; Cependant, en général, l’amplitude doit être élevée et la vitesse de coupe doit être faible.
- Remplissez la chambre d’incubation de la tranche de cerveau (c’est-à-dire le gardien de la tranche de cerveau) avec de l’ACSF et bullez-la avec du carbogène. Placez ensuite la chambre d’incubation dans un bain-marie réglé à 35 °C.
- Obtenir une souris juvénile de l’un ou l’autre sexe, entre 13 jours (p13) et 21 jours (p21, où p0 est la date de naissance).
- Anesthésier la souris avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (55 mg/kg de poids corporel). Une fois que la souris est profondément anesthésiée, comme l’indique l’absence de réflexe de pincement de l’orteil, utilisez rapidement un instrument de guillotine approuvé par un vétérinaire pour décapiter la souris d’un seul mouvement rapide.
note: Préparez l’injection de pentobarbital sodique selon les procédures recommandées par les directives de l’établissement.
- Tenez le nez de la souris pour stabiliser la tête décapitée et faites doucement une incision médiane en commençant entre les yeux de la souris et sur toute la longueur du cuir chevelu pour exposer le crâne. Assurez-vous que le crâne n’est pas comprimé par la pression appliquée par le rasoir. Utilisez le coin du tranchant du rasoir pour augmenter la précision de coupe.
- Écartez les rabats du cuir chevelu de la souris à l'aide des doigts pour exposer le crâne. Ensuite, utilisez le coin frais du bord d'un rasoir pour faire une incision le long de la ligne médiane du crâne ; Faites très attention à éviter tout contact avec le cortex cérébral.
- Insérez une pince à échardes dans les orbites de la souris pour stabiliser la tête décapitée et placez-la dans une boîte de Pétri remplie d'une solution de dissection froide (0 à 4 °C). Assurez-vous que la tête est complètement immergée dans la solution de dissection.
- À l'aide d'une deuxième paire de pinces à échardes, retirez délicatement le cuir chevelu de la souris, retirez l'os du nez en le pelant et retirez l'arrière (côté caudal) du crâne.
note: L’os du nez des souris juvéniles est très mou et se casse facilement.
- Utilisez une micro-spatule pour couper les nerfs optiques, les nerfs trijumeaux et la moelle épinière. Ensuite, utilisez la micro spatule pour séparer doucement le cerveau du crâne. Laissez le cerveau complètement immergé dans la boîte de Pétri remplie de solution de dissection.
3. Préparation de coupes corticales du cortex somatosensori-moteur
- Remplissez le bac tampon du vibratome avec ~150 mL de solution de dissection froide (0 - 4°C).
note: En option, conservez le bac tampon dans le congélateur jusqu’à ce que vous en ayez besoin pour maintenir une température basse pendant la procédure de tranchage.
- Collez le tissu cérébral de la souris sur la platine du vibratome (porte-échantillon/plateau) à l’aide d’une colle adhésive instantanée. Pour les souris, coupez une petite partie caudale du cerveau (c’est-à-dire le cervelet) afin qu’elle puisse être facilement collée à plat sur le porte-échantillon (permettant à la face rostrale du cerveau de faire face au plafond)
note: Alternativement, des tranches horizontales de cerveau de souris peuvent être préparées en collant la face dorsale du cerveau sur le porte-échantillon (la face ventrale du cerveau doit faire face au plafond).
- Placez délicatement le porte-échantillon (avec le tissu cérébral) dans le bac tampon. Assurez-vous que la partie dorsale du cerveau fait face à la lame du vibratome.
note: Il est essentiel de minimiser le temps d’exposition du cerveau à l’air.
4. Section et prélèvement de tissus cérébraux
- Coupez le cerveau en tranches de 450 m d’épaisseur à l’aide du vibratome dans le sens dorsal à ventral. Assurez-vous que le cerveau reste complètement ancré au plateau d’échantillons pendant que vous le coupez.
- Faites la première incision dans le cerveau de la souris pour retirer le bulbe olfactif. Ensuite, effectuez des coupes ultérieures jusqu’à ce que la zone somatosensorielle-motrice soit observée (située à peu près à mi-chemin entre le bulbe olfactif et la bregma).
note: Facultativement, coupez le cerveau en tranches plus fines (200 μm) jusqu’à ce que le corps calleux apparaisse dans la vue coronale du cerveau, ce qui indique que l’aire somatosensorielle-motrice est proche.
- À l’aide d’une pipette de transfert à large diamètre, prélever des coupes coronales (450 μm) contenant la zone somatosensorielle-motrice et les immerger dans une boîte de Pétri contenant une solution de dissection froide (0 à 4 °C).
- Utilisez une nouvelle lame de rasoir et coupez tout excès de tissu des tranches. Pour les coupes coronales de souris, effectuez une coupe transversale juste en dessous de la commissure néocorticale (c’est-à-dire le corps calleux). Ne coupez pas dans un mouvement de sciage ; Il suffit d’appliquer une pression sur la lame dans le tissu et d’utiliser une brosse de détail pour séparer doucement le tissu. Assurez-vous de minimiser le mouvement de la tranche coronale.
- À l’aide d’une pipette de transfert à large diamètre, transférez la partie dorsale des tranches coronales contenant le néocortex (couches 1 à 6) dans une deuxième boîte de Pétri remplie d’ACSF chaud (35 °C) pendant un moment (~1 s). Ensuite, transférez rapidement les tranches dans une chambre d’incubation contenant du carbogéné chaud (35 °C) ACSF.
note: Le but du transfert dans la boîte de Pétri avec ACSF est de minimiser le transfert de la solution de dissection vers la chambre d’incubation tout en transférant des tranches de cerveau avec la pipette à gros calibre. Utilisez les multiples puits de la chambre d'incubation pour garder les différentes tranches de cerveau organisées.
- Jetez le reste de la cervelle et de la carcasse de l’animal conformément aux directives de l’établissement.
5. Incubation et entretien
- Laissez les tranches de cerveau légèrement immergées dans la chambre d’incubation à 35 °C pendant 30 min. Ensuite, retirez la chambre d’incubation du bain-marie et laissez-la revenir à température ambiante (20 - 25 °C). Attendre 1 h que les tranches cérébrales récupèrent avant d’effectuer des enregistrements électrophysiologiques.
note: Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air qui s’accumulent sous les tranches de cerveau dans la chambre d’incubation. Les bulles d’air sont des interfaces d’air qui causent des lésions tissulaires. Les tranches de cerveau de souris peuvent être conservées pendant 6 à 8 h dans une chambre d’incubation bien carbogénée avec ACSF.
6. Enregistrements électrophysiologiques de la couche corticale superficielle
Remarque : Des événements ictaux sont observés dans les enregistrements extracellulaires du potentiel de champ local (LFP) à partir de coupes de cerveau. La LFP de la tranche de cerveau peut être observée et enregistrée à l’aide d’une chambre de type interface ou d’un système de réseau multi-électrodes (MEA) immergé.
- À l’aide d’une pipette de transfert à grand calibre ou d’une brosse de détail, déplacez une tranche de cerveau sur du papier à lentille prédécoupé légèrement plus grand qui est maintenu en place à l’aide d’une pince dentaire. Transférez le papier de l’objectif (sur lequel repose la tranche de cerveau) dans la chambre d’enregistrement et fixez-le en position avec un écran de harpe.
- Passage à chaud (35 °C), le perfusat ACSF carbogéné à travers la chambre d’enregistrement sur la tranche de cerveau à une vitesse de 3 mL/min (~1 goutte/s). Utilisez un thermomètre numérique pour vous assurer que la chambre d’enregistrement est entre 33 et 36 °C.
- Tirez des électrodes en verre d’une impédance de 1 à 3 MΩ à partir d’un tube en verre borosilicaté (d’un diamètre extérieur de 1,5 mm) à l’aide d’un extracteur. Remplissez les électrodes en verre avec de l’ACSF (~10 μL) à l’aide d’une seringue Hamilton. Jetez immédiatement l’électrode si l’embout est endommagé.
note: Blanchir le fil d’argent (5 min) et ne laisser qu’une partie minimale (c’est-à-dire la pointe) du fil d’argent être immergée dans les électrodes de verre remplies à l’arrière de l’ACSF pour minimiser le bruit et la dérive pendant les enregistrements. Retirez tout excès d’ACSF de l’électrode en verre à l’aide d’une seringue Hamilton si nécessaire.
- À l’aide d’un stéréomicroscope 20X, vous guiderez avec précision l’électrode de verre d’enregistrement dans la couche corticale superficielle (2/3) à l’aide de manipulateurs manuels. Enregistrez/visualisez l’activité électrique de la tranche de cerveau sur un ordinateur avec un logiciel standard.
note: Les coupes de cerveau viables (de haute qualité) présenteront un potentiel évoqué robuste en réponse aux stimuli électriques appliqués (100 μs, 30 - 300 μA) ou aux impulsions lumineuses (30 ms, 10 mW/mm2) pour le tissu optogénétique.
7. Induction d’activités ressemblant à des crises
- Perfuser l’ACSF contenant 100 μM de 4-aminopyrimidine (4-AP) sur la tranche de cerveau. Dissoudre 80 mg de 4-AP dans 8,5 mL d’eau pour obtenir une solution mère de 100 mM de 4-AP. Ajouter 100 μL de solution mère de 100 mM de 4-AP à 100 mL d’ACSF pour obtenir un perfusat d’ACSF avec 100 μM de 4-AP.
note: Alternativement, utilisez Zero-Mg2+ ACSF (Tableau 3), une solution ACSF modifiée ne contenant pas de Mg2+ ajouté, pour perfuser la tranche de cerveau. Le temps moyen d’apparition des événements ictaux est de 15 minutes ; Cependant, cela peut prendre jusqu’à 40 minutes pour certaines tranches de cerveau.
8. Génération de crises à la demande : une stratégie optogénétique pour les souris optogénétiques
- Appliquez une brève impulsion (30 ms) de lumière bleue (470 nm) (avec une intensité de sortie minimale de 1 mW/mm2) pour initier un événement ictal. À l’aide d’un manipulateur manuel, positionnez une fibre optique de 1 000 μm de diamètre (0,39 NA) directement au-dessus de la région d’enregistrement.
note: Réglez la fréquence de la photostimulation pour qu’elle corresponde à la fréquence souhaitée de l’occurrence de l’événement ictal (c’est-à-dire 1 impulsion toutes les 50 s). Cependant, le taux ne peut pas être exagéré par rapport au taux intrinsèque auquel les événements ictaux se produisent.
Tableau 1 : Recette pour la solution de dissection.Il s’agit d’instructions pour faire des volumes de 1 L ou 2 L. MW = le poids moléculaire du soluté.
| # | Réactif | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 1L (g) | 2 L (g) |
| 1 | saccharose | 248 | 342,3 | 84,89 | 169,78 |
| deux | Bicarbonate de sodium (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 2,18 | 4,37 |
| 3 | Dextrose (D-glucose) | 10 | 180,16 | 1.8 | 3.6 |
| 4 | Chlorure de potassium (KCl) | deux | 74,55 | 0,15 | 0,3 |
| 5 | Sulfate de magnésium (MgSO4·7H2O) | 3 | 246,47 | 0,74 | 1,48 |
| 6 | Phosphate de sodium monobasique monohydraté (H2NaPO4·H2O) | 1,25 | 137,99 | 0,17 | 0,34 |
| 7 | Chlorure de calcium (CaCl2·2H2O) | 1 | 147.01 | 0,15 | 0,29 |
Tableau 2 : Recette de liquide céphalo-rachidien artificiel pour rongeurs (ACSF).Il s’agit d’instructions pour faire des volumes de 2 L ou 4 L. MW = le poids moléculaire du soluté.
| # | Réactif | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2 L (g) | 4L (g) |
| 1 | Chlorure de sodium (NaCl) | 123 | 58,4 | 14,37 | 28,73 |
| deux | Bicarbonate de sodium (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4,37 | 8,74 |
| 3 | Dextrose (D-glucose) | 10 | 180,16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Chlorure de potassium (KCl) | 4 | 74,55 | 0,6 | 1.19 |
| 5 | Sulfate de magnésium (MgSO4·H2O) | 1.3 | 246,47 | 0,64 | 1,28 |
| 6 | Phosphate de sodium monobasique monohydraté (HNaPO4·H2O) | 1.2 | 137,99 | 0,33 | 0,66 |
| 7 | Chlorure de calcium (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0,44 | 0,88 |
Tableau 3 : Recette de liquide céphalo-rachidien artificiel pour rongeurs Zero-Mg2+ (Zero-Mg2+ ACSF).Il s’agit d’instructions pour faire des volumes de 2 L ou 4 L. MW = le poids moléculaire du soluté.
| # | Réactif | Conc. [mM] | MW (g/mol) | 2 L (g) | 4L (g) |
| 1 | Chlorure de sodium (NaCl) | 123 | 58,4 | 14,37 | 28,73 |
| deux | Bicarbonate de sodium (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4,37 | 8,74 |
| 3 | Dextrose (D-glucose) | 10 | 180,16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Chlorure de potassium (KCl) | 4 | 74,55 | 0,6 | 1.19 |
| 5 | Sulfate de magnésium (MgSO4·H2O) | Nominalement gratuit | 246,47 | 0 | 0 |
| 6 | Phosphate de sodium monobasique monohydraté (HNaPO4·H2O) | 1.2 | 137,99 | 0,33 | 0,66 |
| 7 | Chlorure de calcium (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0,29 | 0,59 |
