Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparer la seringue pour l’injection
- Dissoudre la lysolécithine dans une solution à 1 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; pH 7,4) et la conserver à -20 °C dans de petites aliquotes (75 μl). Décongeler un flacon à température ambiante (RT).
REMARQUE : Si la lysolécithine n’est pas dissoute, sonicer le tube dans un nettoyeur à ultrasons (40 kHz) pendant environ 30 min pour former une solution uniforme.
- Manipulez le capillaire en verre pré-tiré avec un soin extrême pour éviter d’endommager la pointe délicate. Dévissez l’écrou d’une seringue d’injection de 10 μl et vissez-le sur l’extrémité plate du capillaire, puis sur deux embouts, en veillant à ce que les extrémités correspondantes des embouts s’alignent et que le capillaire soit bien ajusté dans l’embout conique (Figure 1). Rincez la seringue avec de l’alcool isopropylique et retirez le piston. Une fois sec, vissez l’ensemble d’aiguille à la main sur la seringue d’injection.
- Fixez l’aiguille de moyeu métallique à la seringue d’amorçage. Percez un disque en caoutchouc avec l’aiguille et faites-le glisser vers le bas jusqu’à la base. Remplissez la seringue d’amorçage avec de la lysolécithine. Appuyez doucement sur la seringue d’amorçage jusqu’à ce que du liquide soit visible à la pointe de l’aiguille. Cela garantit qu’aucune bulle d’air ne sera introduite dans la seringue d’injection.
- Insérez l’aiguille métallique de la seringue d’amorçage dans la seringue d’injection. En établissant un joint ferme avec le disque en caoutchouc, appuyez lentement sur la seringue d’amorçage jusqu’à ce que le capillaire remplisse l’embout de solution. Retirez délicatement la seringue d’amorçage tout en appuyant simultanément pour remplir le corps de la seringue d’injection sans introduire de bulles d’air. Insérez le piston dans la seringue d’injection et assurez-vous que la solution s’écoule de l’extrémité du capillaire pendant que le piston est doucement enfoncé.
REMARQUE : Si des bulles d’air sont visibles dans la seringue capillaire ou d’injection, la préparation de la seringue doit être répétée depuis le début. Un fluide continu dans l’appareil d’injection est essentiel pour garantir des volumes d’injection précis.
- Fixez la seringue d’injection terminée au bras d’un micromanipulateur stéréotaxique. Cet appareil terminé sera capable d’injecter 15 à 20 animaux avant de devoir être rechargé.
- Jetez la lysolécithine restante de la seringue d’amorçage. Retirez et appuyez plusieurs fois sur l’alcool isopropylique, puis détachez l’aiguille du moyeu métallique. Attendez plusieurs heures que l’alcool isopropylique restant dans la seringue d’amorçage s’évapore avant de remplir à nouveau.
2. Préparez l’animal à l’intervention chirurgicale
REMARQUE : Cette procédure est décrite pour les souris femelles C57BL/6 âgées de 8 à 10 semaines.
- Anesthésier l’animal par une injection intrapéritonéale de kétamine (200 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) ou conformément à la réglementation institutionnelle sur les soins aux animaux. Prévoyez que l’animal soit sous anesthésie pendant environ 1 heure s’il utilise une anesthésie injectable.
- Testez que l’animal est profondément anesthésié en pinçant fermement le pied. Un animal correctement anesthésié ne répondra pas au pincement.
- À l’aide d’une tondeuse, rasez une zone de 2-3 cm2 sur la face dorsale de l’animal, près des oreilles. Attention à ne pas endommager les oreilles.
- Essuyez la zone avec de l’éthanol à 70 % appliqué sur un tampon de gaze. Assurez-vous que tous les cheveux coupés ont été retirés de la zone. Désinfectez la zone avec de l’iode.
- Appliquez de la vaseline sur les yeux pour éviter le dessèchement tout au long de la procédure.
- Gardez l’animal dans une chambre de récupération chauffée jusqu’à ce qu’il soit prêt à commencer la procédure.
3. Effectuer l’intervention chirurgicale
REMARQUE : Assurez-vous d’une technique d’asepsie adéquate pour toutes les étapes de la procédure. Cela comprend l’utilisation appropriée de gants, de filets à cheveux, de masques et de rideaux. Tous les outils doivent être stérilisés avant d’entrer en contact avec l’animal.
- Déplacez l’animal vers un cadre stéréotaxique, côté dorsal vers le haut, surélevé à mi-chemin par des serviettes en papier pliées pour exagérer la courbure de la colonne vertébrale. Fixez les bras et la queue avec du ruban chirurgical et fixez la tête avec une pince à dents. Les barres d’oreille stabilisatrices ne sont pas nécessaires pour cette procédure.
- À l’aide d’un scalpel, faites une incision médiane de 3 cm, en commençant juste en dessous des oreilles et en coupant dans le sens caudal.
- Localisez la division entre les deux grandes structures adipeuses et utilisez des pinces fines dans chaque main pour les séparer. Écartez les écarteurs pour ouvrir le champ opératoire.
- À l’aide d’un microscope chirurgical, repérez l’apophyse proéminente de la vertèbre thoracique 2 (T2) (REMARQUE : Cette caractéristique est caractéristique de la souche de souris C57BL/6). Effectuez une dissection émoussée avec des ciseaux à ressort fermés à travers la musculature superposée pour mieux visualiser T2. À l’aide de la pince, palpez les surfaces dures de la vertèbre thoracique 3 (T3) et de la vertèbre thoracique 4 (T4) pour confirmer l’emplacement anatomique approprié.
- À l’aide de ciseaux à ressort, faites des coupes latérales peu profondes (2-3 mm de profondeur) du tissu conjonctif entre T3 et T4. En raison de l’espacement naturel entre les vertèbres de la partie thoracique supérieure de la colonne vertébrale de la souris, une laminectomie n’est pas nécessaire pour révéler la moelle épinière. N’oubliez pas qu’une coupure trop profonde percera et endommagera le cordon.
REMARQUE : Un petit saignement est courant pendant cette étape. Si cela se produit, tenez une lance éponge dans la zone jusqu’à ce que le saignement disparaisse (30-60 sec).
- Visualisez la moelle épinière. Il sera recouvert d’une épaisse couche de dure-mère visible si cette couche méningée n’est pas encore coupée lors de l’exposition du cordon. Un vaisseau sanguin proéminent traverse la ligne médiane approximative de la moelle épinière.
REMARQUE : Ce système vasculaire ne doit pas être utilisé comme point de repère pour la ligne médiane. Au lieu de cela, un éclairage adéquat devrait révéler les limites de matière grise-blanche flanquant la colonne dorsale, ce qui devrait être utilisé pour estimer la ligne médiane.
- Si la dure-mère reste intacte, effectuez de légers grattages latéraux avec une aiguille métallique de 32 G jusqu’à ce qu’elle soit dégagée. L’objectif est d’enlever la dure-mère sans couper les méninges sous-jacentes restantes, qui ne sont pas aussi épaisses et plus difficiles à voir.
REMARQUE : La libération de liquide céphalo-rachidien indique une brèche de l’arachnoïde, et bien que cela puisse se produire sans dommages mécaniques aux tissus, le liquide céphalo-rachidien accumulé doit être enlevé avec une lance éponge pour mieux visualiser la surface du cordon.
- Déplacez la seringue d’injection en place et abaissez-la lentement jusqu’à ce que l’extrémité du capillaire touche à peine la moelle épinière immédiatement latérale de chaque côté de la ligne médiane. Verrouillez le bras en place.
- Utilisez les mesures graduées du bras stéréotaxique dans la direction Z pour effectuer une mesure de position de base. De cette lecture, soustrayez 1,3 mm. Utilisez un mouvement rapide et peu profond vers le bas pour percer le tissu et abaissez soigneusement le capillaire jusqu’à ce que la nouvelle mesure soit atteinte. Facultatif : si vous le souhaitez, les lésions de la colonne dorsale peuvent être produites par le même mouvement de perçage sur la ligne médiane et une profondeur de 0,3 mm.
REMARQUE : Ces valeurs sont spécifiques pour l’injection entre T3 et T4. Si vous choisissez d’effectuer l’injection à un autre endroit de la moelle épinière, ces valeurs doivent être dérivées de tout atlas cérébral de souris disponible.
- Utilisez le micromanipulateur pour abaisser la lysolécithine dans la substance blanche de la moelle épinière ventrale. Effectuez une rotation du micromanipulateur toutes les 5 secondes pendant 2 min, ce qui permet d’obtenir un volume final de 0,5 μl. Laissez le capillaire en place pendant 2 minutes supplémentaires pour éviter le reflux de la solution, puis retirez délicatement le capillaire.
- Attachez une seule suture dans le muscle/tissu adipeux recouvrant la colonne vertébrale. Utilisez une suture non interrompue pour fermer la peau. Appliquez plus d’iode sur le site d’incision.
- Placez l’animal dans une chambre de récupération chauffée jusqu’à ce qu’il se rétablisse, puis remettez-le dans sa cage. Appliquer des analgésiques après l’opération conformément aux règlements de l’établissement en matière de soins aux animaux. Des soins postopératoires supplémentaires ne sont généralement pas nécessaires car les animaux sont entièrement ambulatoires et capables de se nourrir et de boire eux-mêmes dès qu’ils se remettent de l’anesthésie.
- Répétez la procédure pour les autres animaux.
REMARQUE : Avec de la compétence, l’opération peut être terminée en 10-15 minutes par animal, en particulier avec l’aide d’une deuxième personne qui attache des sutures. Le même capillaire en verre peut être utilisé pour environ 15 à 20 interventions chirurgicales avant que l’embout ne devienne émoussé et ne doive être remplacé. Les chirurgies de contrôle peuvent être effectuées de la même manière que décrite, avec une injection de PBS dans la moelle épinière au lieu de la lysolécithine. Nous ne recommandons pas le nettoyage des capillaires pour une utilisation future.
