Induction d’une lésion neuronale ciblée à l’aide d’un laser de haute puissance chez une larve de drosophile

Résumé

Source : Li, D., Li, F., et al. Un modèle de lésion in vivo de la drosophile pour l’étude de la neurorégénération dans le système nerveux périphérique et central. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo montre une méthode permettant d’induire des lésions neuronales ciblées chez les larves de drosophile à l’aide d’un laser de haute puissance. Après avoir positionné la larve au microscope, un laser de faible puissance recherche des neurones fluorescents, puis la puissance du laser est augmentée pour induire des dommages localisés. La blessure est confirmée par une fluorescence accrue et un cratère sur le site de la blessure.

Protocole

1. Lésion à deux photons et imagerie confocale

1. Configuration du microscope
   REMARQUE : Un microscope confocal à balayage laser avec un laser à deux photons a été utilisé pour cette expérience, mais d’autres systèmes avec une configuration équivalente suffiront également. Le laser à deux photons (930 nm) a été utilisé pour l’administration des lésions et un laser à l’argon (488 nm) a été utilisé pour l’imagerie confocale de la GFP.
   1. Au début de chaque séance, allumez le laser à deux photons et/ou le(s) laser(s) confocal(s) et le microscope. Ensuite, ouvrez le logiciel d’imagerie.
   2. Pour les lésions à deux photons, configurez les paramètres suivants pour l’imagerie GFP avec le laser à deux photons à 930 nm (1 950 mW).
      1. Sélectionnez le mode de balayage linéaire. Ouvrez complètement le sténopé. Augmentez l’intensité du laser à ~20 % (390 mW).
      2. Sélectionnez 512 x 512 comme balayage de l’image. Utilisez la vitesse de balayage maximale (généralement avec un temps de séjour des pixels de 0,77 μs). Assurez-vous que le nombre moyen est de 1 et que la profondeur de bits est de 8 bits.
      3. Réglez le gain sur ~750 et le décalage sur 0.
      4. Enregistrez ce protocole expérimental prédéfini en tant qu’ablation 2P GFP 930, ce qui permet une réutilisation facile dans de futures expériences.
   3. Pour l’imagerie confocale, configurez les paramètres suivants pour l’imagerie GFP avec le laser Argon à 488 nm :
      1. Sélectionnez l’onglet Acquisition, puis Z-stack.
      2. Sous « Laser », allumez l’alimentation du laser Argon 488 nm.
      3. Allez dans Canaux, sélectionnez le laser de 488 mm et augmentez la puissance du laser à 5-10 %. Pour le sténopé, utilisez l’unité d’aération 1-2 (AU). Réglez le gain à 650.
      4. En mode d’acquisition, sélectionnez 1024 x 1024 comme balayage de trame, utilisez la vitesse de balayage maximale, un nombre moyen de 2 et une profondeur de bits de 8 bits.
      5. Enregistrez ce protocole expérimental prédéfini en tant qu’imagerie GFP (protéine fluorescente verte).
2. Anesthésie des larves avec éther diéthylique et montage
   1. Dans une hotte, placez un plat en verre de 60 mm dans une boîte de Pétri en plastique de 15 cm. Pliez et posez un morceau de papier de soie au fond du plat en verre, puis placez une plaque de gélose au jus de raisin sur le tissu. Ajoutez de l’éther diéthylique dans le plat en verre, jusqu’à ce que le papier de soie soit trempé et qu’il reste une couche d’éther liquide dans le plat. Gardez le couvercle en tout temps.
   2. Préparez une lame de verre avec une goutte d’huile d’halocarbure 27 au centre. Ajoutez 4 points de graisse sous vide sur les quatre coins de la glissière, pour soutenir plus tard la lamelle.
   3. À l’aide d’une pince, prélevez une larve nettoyée et placez-la sur la plaque de gélose dans le plat en verre de 60 mm. Couvrez le plat en verre avec son couvercle et attendez que la larve cesse de bouger. Pour les blessures/imagerie SNP, retirez la larve dès que sa queue cesse de se contracter. Pour le SNC, attendez que toute la larve devienne immobile, en particulier les segments de tête.
      REMARQUE : Le moment de l’exposition à l’éther est critique. Voir Discussion.
   4. Ramassez soigneusement la larve anesthésiée et placez-la la tête vers le haut dans la goutte d’huile d’halocarbure sur la lame. Ajoutez une lamelle sur le dessus de la diapositive. Appliquez une légère pression sur la lamelle jusqu’à ce qu’elle touche la larve (figure 1A).
   5. Ajustez la position de la larve en poussant doucement la lamelle vers la gauche ou la droite pour faire rouler la larve, de sorte que le neurone/axone/dendrite d'intérêt soit en haut et le plus proche de la lentille du microscope.
   6. En cas de blessure au SNP, montez la larve côté dorsal vers le haut, de sorte que les deux trachées soient visibles. Ensuite, roulez la larve de ~30 degrés vers la gauche pour blesser les axones de neurones da de classe III (figures 1B et 1C), 90 degrés pour blesser les axones de neurones da de classe IV (figures 1B et 1E), ou ~30 degrés pour blesser les dendrites de neurones da de classe IV.
   7. En cas de lésion du SNC, positionnez la larve de manière à ce qu’elle soit parfaitement ventrale vers le haut, de sorte que la région d’intérêt soit la plus proche de la lentille du microscope dans le plan z.
3. Lésions par laser à deux photons
   1. Placez la lame avec la larve sous le microscope et fixez-la en place avec le support de lame sur la platine. Utilisez l’objectif 10X (0,3 NA) pour trouver la larve.
   2. Ajoutez 1 goutte d’huile d’objectif sur la lamelle, passez à l’objectif 40X (1,3 NA) et ajustez la mise au point.
   3. Passez en mode balayage et réutilisez le protocole expérimental 2P GFP 930 Ablation. Assurez-vous que le sténopé est complètement ouvert.
      REMARQUE : La configuration doit être optimisée en fonction de chaque système.
   4. Démarrez le mode Live pour localiser la région d’intérêt (ROI) et affinez les paramètres pour obtenir une bonne qualité d’image avec le zoom.
      approprié REMARQUE : Le but de cette étape est de trouver le neurone/l’axone/la dendrite à blesser, plutôt que de prendre l’image de la meilleure qualité. Par conséquent, utilisez les paramètres minimaux suffisants pour visualiser la zone cible, afin d’éviter la surexposition ou le photoblanchiment.
   5. Arrêtez l’analyse en direct, afin que le bouton Recadrer devienne disponible. Laissez l’image fixe servir de feuille de route. Sélectionnez la fonction Recadrage et ajustez la fenêtre de balayage pour vous concentrer sur la cible à blesser.
   6. Réduire le retour sur investissement à la taille du site potentiel de la blessure. Par exemple, il suffit de couvrir la largeur d’un axone ou d’une dendrite, pour assurer la précision de la blessure et réduire les dommages aux tissus voisins. Si vous le souhaitez, zoomez sur le retour d’investissement avant de recadrer, ce qui permet d’obtenir des dommages plus précis.
   7. Ouvrez une nouvelle fenêtre d’imagerie. Réduisez la vitesse de balayage et augmentez l’intensité du laser. Déterminez l’augmentation de l’intensité du laser en fonction du signal de fluorescence tissulaire balayé en mode Live.
   8. En règle générale, réglez l’intensité du laser à deux photons à partir de 25 % pour les lésions PNS et de 50 à 100 % pour les lésions VNC. Pour les lésions axonales PNS, assurez-vous que l’intensité laser est de ~480 mW et que le temps de séjour des pixels est de 8,19 μs. Pour la lésion de l’axone VNC, assurez-vous que l’intensité du laser et le temps de séjour des pixels sont généralement de 965-1930 mW et de 8,19-32,77 μs, respectivement.
   9. Lancez l’analyse continue. Laissez le curseur de la souris sur le bouton Continu. Gardez un œil attentif sur l’image et arrêtez le balayage dès qu’une augmentation drastique de la fluorescence est observée.
      REMARQUE : L’apparition du pic de fluorescence est due à l’auto-fluorescence au site de la blessure.
   10. Revenez au mode Live en réutilisant les paramètres. Trouvez la région d’intérêt qui vient d’être ciblée en ajustant le focus.
       REMARQUE : Une bonne indication d’une blessure réussie est l’apparition d’un petit cratère, d’une structure en forme d’anneau ou de débris localisés juste à l’endroit de la blessure.
   11. Passez au neurone suivant et répétez à partir de l’étape 1.3.5, pour blesser plusieurs neurones chez un seul animal. Ou répétez l’étape 3.3.5 tout en augmentant progressivement la puissance et/ou en réduisant la vitesse de balayage si la blessure initiale était insuffisante.
       REMARQUE : Dans le cas où la puissance laser est trop élevée, une grande zone endommagée sera visible dans l’image de balayage en direct après la blessure. Trop de blessures peuvent entraîner la mort de la larve.
   12. Récupérez la larve en retirant soigneusement la lamelle et en transférant la larve blessée sur une nouvelle plaque avec de la pâte de levure. Creusez plusieurs grottes sur la plaque de gélose avec des pinces ; Alternativement, faites un îlot d’agar dans la plaque au lieu d’utiliser toute la plaque, afin de réduire la possibilité que la larve rampe hors de la plaque.
   13. Placez la plaque dans une boîte de Pétri de 60 mm avec un tissu humide (imbibé d’une solution d’acide propionique à 0,5 %) et cultivez à température ambiante ou à 25°C
       REMARQUE : La larve restera au stade larvaire pendant environ une journée supplémentaire à température ambiante (22 °C) par rapport à 25 °C.

Résultats

Graphique 1 : La régénération des axones du neurone Da à la périphérie présente une spécificité de classe. (A et B) Schéma montrant la position des larves. (C) Dessin schématique de neurones da de classe III. (D) Les axones des neurones da de classe III ddaF, marqués avec 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, ne parviennent pas à repousser. (E) Dessin schématique de neurones da de classe ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Éther diéthylique, réactif ACS, anhydre	Acros Organics	AC615080010
Huile d’halocarbure 27	Genesee Scientific	59-133
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS), concentré 20x, pH 7,5, fournisseur # E703-1L	VWR	97062-948
Poudre d’agar, Alfa Aesar, 500GM	VWR	AAA10752-36
Jus de raisin	Welch's
Éthanol à 95 % (Alcool réactif à 95 %)	VWR	64-17-5
Acide acétique	Sigma-Aldrich	A6283
Acide propionique	J.T.Baker	U33007
Lunettes de couverture : Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Microscope à balayage laser Zeiss LSM 880	Zeiss
Logiciel Zen	Zeiss
Chameleon Ultra II	Cohérent