1. Préparation des milieux et des réactifs
- Décongeler le revêtement de la matrice de la membrane basale pour les plaques de culture à 4 °C (ne pas laisser la matrice de la membrane basale se réchauffer, sinon elle se solidifiera). Préparez 1 mL d’aliquotes et conservez-les à -20 °C ou -70 °C.
- Reconstituer le facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) à 10 μg/mL et faire des aliquotes de 10 μL. Conservez-les à 4 °C.
- À une nouvelle bouteille de 500 mL de DMEM/F12 avec glutamine, non ouverte, ajoutez B27 (10 mL), N2 (5 mL) et de la pénicilline-streptomycine (5 mL). Placez 50 ml de ce milieu de cellules souches neurales (NSC) dans un tube conique et ajoutez 10 μL de bFGF à 10 μg/μL (2 μg/mL final). Stockez le support bFGF NSC (+) à 4 °C.
- Pour créer un (-) support bFGF, utilisez la même recette que celle décrite à l’étape 1.3, mais n’ajoutez pas de bFGF. Ce milieu sera utilisé pour différencier les NSC en neurones et pour maintenir les cultures neuronales après la différenciation.
2. Constructions lentivirales
REMARQUE : Avant de commencer à travailler avec des constructions lentivirales, assurez-vous que le laboratoire a été approuvé pour utiliser des agents de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). De plus, des cagoules de culture BSL-2, de l’équipement de protection individuelle (EPI) et des méthodes d’élimination doivent être utilisés lors du travail avec des vecteurs lentiviraux.
- Obtenir des constructions tau emballées dans le lentivirus à partir d’une source préférée.
3. Culture de cellules souches neurales humaines
REMARQUE : Les NSC sont généralement ensemencées à 100 000–150 000 cellules/cm2 et la plupart des NSC disponibles dans le commerce sont vendues sous forme de 1 x 106 cellules/flacon. Ce protocole a été optimisé pour les boîtes de culture cellulaire de 10 cm (bien que d’autres tailles de boîtes puissent être utilisées) ; par conséquent, si des NSC disponibles dans le commerce sont utilisées, il peut être nécessaire de les développer en les cultivant d’abord dans des boîtes à six puits afin d’obtenir suffisamment de cellules pour ensemencer des boîtes de 10 cm. Ce protocole peut également être adapté à une variété de tailles de boîtes de culture cellulaire.
- Pour la préparation des plaques de culture cellulaire, prélever une aliquote de la matrice de membrane basale congelée pour les plaques de culture cellulaire et la laisser décongeler à 4 °C (les aliquotes peuvent être placées à 4 °C pendant la nuit la veille de l’ensemencement des cellules). Ajouter 385 μL de revêtement matriciel de membrane basale à 5 mL de milieu DMEM/F12 + pénicilline-streptomycine.
REMARQUE : 5 mL de milieu DMEM/F12 + pénicilline-streptomycine suffisent pour enrober une seule boîte de 10 cm (1 mL de cette solution de revêtement de matrice à membrane basale est suffisant pour enrober un puits d’une boîte à six puits). Alternativement, si les cellules doivent être fixées et immunocolorées, ou colorées pour la thioflavine, cultiver des cellules sur des lamelles en verre dans des boîtes de culture à 24 puits.
- Gardez le milieu et l’enrobage de matrice froids avant et pendant leur ajout dans les boîtes de culture. Ajouter le revêtement matriciel de la membrane basale dans les boîtes de culture et placer les boîtes dans un incubateur (à 37 °C) pendant 1 h. Pour un revêtement optimal, ne pas incuber la matrice de la membrane basale pendant plus ou moins de 1 h. Après 1 h, aspirez le revêtement de la matrice de la membrane basale des boîtes de cultures cellulaires. Assurez-vous que cela coïncide avec le fait que les NSC sont prêts à être plaqués.
REMARQUE : Si les cellules ne sont pas décongelées à partir de stocks congelés, sautez l’étape 3.2 et passez à l’étape 3.3.
- Si des cellules sont décongelées à partir de stocks de NSC congelés, prenez une fiole de cellules congelées et réchauffez-la dans un bain-marie chauffé à 37 °C en déplaçant la fiole d’avant en arrière dans l’eau. Une fois décongelé, vaporisez le flacon avec de l’éthanol à 70 % et placez-le dans une hotte de culture cellulaire. Transférez les cellules dans ~10 mL de milieu DMEM/F12 + pénicilline-streptomycine et centrifugez le tube à température ambiante à 1 000 x g pendant 5 min. Aspirez le milieu et remettez les cellules en suspension dans le milieu NSC.
- Diluer les cellules dans un milieu NSC pour obtenir la densité d’ensemencement appropriée pour le récipient de culture cellulaire utilisé.
REMARQUE : Par exemple, si les NSC sont placés sur une plaque à six puits — un puits sur une boîte de culture à six puits a une surface de 9 cm2—900 000 à 1 350 000 cellules sont nécessaires pour l’ensemencement. Ainsi, un flacon contenant 1 000 000 de cellules peut être remis en suspension dans 2 ml de milieu et ajouté à un seul puits d’une boîte à six puits.
- Ajouter suffisamment de cellules en suspension dans le milieu NSC pour ensemencer les boîtes de culture enrobées de matrice de la membrane basale (100 000 cellules/cm2) et changer le milieu tous les deux jours (si vous utilisez un bouillon congelé, changer le milieu le lendemain du placage et tous les deux jours par la suite). Cultivez les cellules jusqu’à ce qu’elles soient confluentes de 75 à 80 %.
REMARQUE : Les cellules atteindront probablement une confluence de 75 % à 80 % peu de temps après le placage, mais cela peut prendre plus de temps si des stocks congelés sont utilisés.
- Une fois que les NSC sont confluents de 75 % à 80 %, commencez la différenciation neuronale en supprimant le milieu NSC (+) bFGF et en le remplaçant par le milieu NSC (-) bFGF. Cultivez les cellules dans ce milieu (en remplaçant le milieu tous les deux jours) pendant au moins 4 semaines.
REMARQUE : Les cellules continueront à se diviser pendant quelques jours après le retrait du bFGF ; Par conséquent, les cellules peuvent atteindre une confluence de 90 à 100 %.
- Après une culture de 4 semaines, les cellules auront atteint un destin neuronal et seront prêtes pour le traitement du lentivirus.
4. Transduction et maintenance des cultures neuronales
- Pour transduire des neurones avec un lentivirus, utilisez un nombre de titres de 3,4 x 105 unités/cellule transductibles (une boîte de 10 cm 100 % confluente contiendra ~10 millions de neurones). Diluez les unités transductibles à la concentration nécessaire dans un milieu de culture cellulaire et ajoutez-les aux cellules (utilisez le volume normal de milieu pour la boîte de culture cellulaire). Deux jours après l’ajout du lentivirus, laver les cellules 1x avec un milieu frais (-) bFGF (sans lentivirus) et poursuivre la culture dans un milieu (-) bFGF comme d’habitude.
- Pour le traitement post-lentiviral, nourrissez les neurones transduits en changeant le milieu de culture cellulaire ([-] milieu bFGF) tous les deux jours. Maintenez les cellules pendant ~8 semaines après la transduction. Visualisez régulièrement les cellules au microscope optique pour assurer leur viabilité.
REMARQUE : La rareté ou les cassures dendritiques sont des signes que les cellules ne sont plus viables.
