Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparatifs
- Modifier un cathéter veineux périphérique de 16 G pour l’intubation. Pour modifier, raccourcissez l’aiguille de 1 cm et pliez le distal restant de 1 cm sur 30° vers la valve d’injection. Retirez les ailes du cathéter (à usage multiple).
- Pour fabriquer une sonde de pression intracrânienne ou ICP, coupez un morceau de tube en polyéthylène de 20 mm (diamètre intérieur (ID) : 0,58 mm, diamètre extérieur (OD) : 0,96 mm) et brûlez une extrémité pour former une plaque circulaire, en gardant une lumière ouverte. Contournez le tube en polyéthylène avec 1 mm de tube en silicone (ID : 1,0 mm, OD : 3,0 mm) avant de connecter 10 mm de tube en silicone (ID : 0,76 mm, OD : 2,4 mm) à l’extrémité du tube en polyéthylène.
- Allumez l’ordinateur portable et ouvrez le logiciel d’acquisition de données. Étalonnez les transducteurs de pression artérielle (PA) et de pression intracérébrale (ICP) ainsi que le laser-Doppler selon les instructions du fabricant.
- Préparez l’appareil d’analyse des gaz du sang.
prudence: Assurez-vous qu’il y a suffisamment d’isoflurane dans le vaporisateur.
- Allumez le O2 et le flux d’air atmosphérique. Réglez le débit de O2 à 30 % et celui de l’air atmosphérique à 70 %.
- Placez le coussin chauffant et réglez la température à 37 °C.
2. Anesthésie
- Placez le rat dans la chambre d’anesthésie avec un débit de 30 % d’O2 et 70 % d’air atmosphérique. Administrer 5 % de gaz isoflurane dans la chambre. L’anesthésie adéquate prendra environ 4 min. Contrôlez soigneusement la respiration.
- Une fois anesthésié, placez le rat en position couchée sur une plaque lourde contournée par un élastique. Placez les dents de devant du rat sous l’élastique.
- Tirez la langue avec précaution à l’aide d’une pince incurvée. Nettoyez le larynx à l’aide d’un coton-tige. Placez une lumière externe sur la ligne médiane de la gorge pour visualiser les cordes vocales.
- Intuber pendant l’inspiration à l’aide du cathéter veineux périphérique 16 G modifié. Lorsqu’il est correctement inséré, retirez le talon aiguille. Connectez le cathéter au ventilateur.
note: Le placement correct du tube est confirmé par des mouvements de la poitrine synchronisés avec la fréquence respiratoire. Si des mouvements de l’abdomen sont observés, extubez et réintroduisez le rat dans la cloche d’anesthésie. Ne répétez pas la procédure plus de trois fois en raison du risque d’endommager les voies respiratoires.
- Lorsqu’il est intubé, maintenez l’animal sous respiration artificielle avec 30 % d’O2 et 70 % d’air atmosphérique. Maintenez l’anesthésie à 1,5 % à 3 % d’isoflurane. Ajustez l’isoflurane pour maintenir la pression artérielle entre 80 et 100 mmHg.
- Maintenez le volume inspiratoire du respirateur à 3 mL et la fréquence à 40-45 inspirations/min. Ajustez le volume inspiratoire en fonction de l’analyse des gaz du sang.
- Faites un point de suture à travers les tissus mous internes de la joue avec une suture 2-0. Attachez la suture autour du tube d’injection et de la valve d’injection du cathéter veineux périphérique pour fixer le cathéter.
- Déplacez le rat vers le champ d’opération et placez-le en position couchée, la queue tournée vers le chirurgien.
- Appliquez le gel pour les yeux si nécessaire pour contrer la sécheresse oculaire.
- Effectuez un pincement des orteils pour confirmer une profondeur d’anesthésie adéquate. Évaluer et maintenir la profondeur de l’anesthésie pendant la chirurgie.
3. Cathéter de queue
- Désinfecter les 3-4 cm proximaux de la queue avec 0,5 % de chlorhexidine éthanol.
note: Désormais, utilisez le microscope chirurgical à la discrétion du chirurgien.
- Faites une incision cutanée de 15 à 20 mm à l’extrémité proximale de la queue sur le côté ventral. Attention à ne pas inciser l’artère.
- Détachez la peau du tissu conjonctif sous-jacent à l’aide d’une pince incurvée.
- Pénétrez soigneusement le fascia en exposant l’artère.
- Relâchez avec précaution l’artère caudale du tissu sous-jacent à l’aide d’une pince incurvée.
- Glissez trois fils de soie noire sous le récipient. Placez un fil aussi distalement que possible et faites un nœud chirurgical étroitement autour de l’artère. Tenez les extrémités libres du fil avec un hémostat.
- Attachez les deux fils restants sans serrer autour de l’artère.
- Poussez le fil proximal aussi proximal que possible. Appliquez un hémostat pour maintenir les extrémités du fil proximal. Tirez légèrement sur l’hémostat, mais suffisamment pour restreindre et bloquer le flux sanguin. Placez l’hémostat sur l’abdomen.
- Coupez l’extrémité du cathéter à un angle de 45°. Coupez la pointe acérée pour éviter la pénétration de la paroi artérielle.
- À l'aide d'un ciseau Vannas, faites une incision artérielle de 1/3 du diamètre de l'artère à un angle de 30°, à 3-5 mm du nœud distal.
- Insérez le cathéter dans l’artère à l’aide de deux pinces droites. Utilisez une pince pour tenir le cathéter et l’autre pour tirer délicatement l’artère sur le cathéter.
- Insérez le cathéter dans le vaisseau jusqu’au nœud proximal et desserrez le nœud de l’hémostat. Visualisez le flux sanguin dans le cathéter. Fixez le fil du milieu sans serrer au cathéter.
- Poursuivez l’insertion jusqu’au point où l’artère est à nouveau recouverte par le fascia et, si possible, juste au-delà.
- Contrôlez l’emplacement du cathéter et la fuite éventuelle en rinçant avec une solution saline.
- Fixez les deux fils proximaux à l’aide de nœuds chirurgicaux.
note: La mesure de la pression artérielle doit être pulsatile ; Si ce n’est pas le cas, le cathéter n’est pas correctement placé.
- Fixez le cathéter à l’extrémité de l’incision en faisant un nœud chirurgical à l’aide du fil distal.
- Cousez l’incision cutanée sans serrer avec deux sutures monofilament 4-0 non résorbables. Attention à ne pas pénétrer dans le cathéter.
note: Tout au long de la chirurgie, soyez conscient de l’amplitude de la pulsation. Si ce niveau est faible, rincez le cathéter avec une solution saline.
- Desserrez le cathéter artériel du transducteur de pression pour permettre la circulation sanguine pour l’échantillonnage des gaz sanguins. Placez un tube microcapillaire à l’extrémité du cathéter. Laissez le sang circuler dans le tube. Rattachez le cathéter au transducteur après le prélèvement sanguin et rincez le cathéter.
- Insérez le tube capillaire dans l’analyseur de gaz du sang. Mesurez le pH, le pCO2 et le pO2 et notez-les < br />
REMARQUE : En fonction des valeurs de gaz sanguin et de pression artérielle, modifiez le taux de ventilation. Si la pression artérielle moyenne (MAP) est trop basse, essayez de baisser le débit d’isoflurane. Testez les réflexes pour vous assurer que l’anesthésie est à la bonne profondeur.
4. Sonde ICP
- Placez le rat dans le cadre stéréotaxique. Il est important de positionner le rat de manière symétrique.
- Placez un oreiller cylindrique sous le cadre stéréotaxique pour créer une flexion antérieure du cou.
- Rasez le cuir chevelu, le cou et la zone derrière les oreilles du rat. Retirez les cheveux superflus.
- Désinfectez la zone avec 0,5 % de chlorhexidine éthanol.
- Anesthésier localement avec 0,7 mL de lidocaïne à 10 mg/5 μg/mL avec adrénaline, insérer l’aiguille à l’extrémité caudale du crâne sur la ligne médiane. Injecter dans la musculature du cou avec 0,3-0,4 mL. Injectez le reste par voie sous-cutanée autour et en avant du bregma.
- Faites une incision cutanée à partir de la piqûre de l’aiguille de ~8 mm caudalement dans la ligne médiane.
- Disséquez tous les muscles en couches pour identifier la membrane atlanto-to-ccipitale (triangle de couleur marbrée vers la caudale du crâne sur la ligne médiane).
- Utilisez l’écarteur Alm pour restreindre la musculature du cou. Placez l’écarteur à broches dans le sens caudal si nécessaire.
- Vérifiez si la sonde ICP stérile est connectée à la sonde ICP. Rincez la sonde ICP avec une solution saline. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la sonde ICP.
- Inciser la membrane atlanto-curcipitale à l’aide d’une aiguille de 23 G. Faites un trou pour faire passer la sonde ICP à travers la membrane.
- Faites passer doucement la sonde à travers la membrane atlanto-to-cipitale. Tirez légèrement la sonde et assurez-vous qu’elle présente une courbe de pulsation comprise entre 0 et 5 mmHg. Si ce n’est pas le cas, retirez la sonde, vérifiez la connexion au transducteur et confirmez le flux à travers la lumière.
- Appliquez deux gouttes de colle pour tissu. Déplacez le tube en silicone de 1 mm vers l’avant jusqu’à la membrane et appliquez de la colle supplémentaire pour minimiser le risque de déplacement de la sonde ICP.
- Retirez le(s) enrouleur(s).
- Faites une suture horizontale du matelas à l’extrémité céphalique de l’incision et une simple suture interrompue à l’extrémité caudale à l’aide d’une suture monofilament 4-0 non résorbable.
5. Placement de l’aiguille et de la sonde Laser-Doppler
- Faites une incision sur la ligne médiane, juste en avant des yeux, à 15 mm dans le sens de la queue.
- Retirez le tissu conjonctif et les muscles à l’aide d’une pince. Utilisez l’extrémité d’un coton-tige stérile comme rougine permettant d’identifier le bregma et les sutures coronales.
- Placez l’écarteur Alm.
- Placez une aiguille spinale de 25 g dans le cadre stéréotaxique. Placez l’aiguille exactement sur le bregma et notez la position.
note: Placez l’articulation médiane du cadre stéréotaxique à 30° vers l’animal dans le plan vertical.
- Retirez l’aiguille de la bregma, déplacez le cadre de 65 mm vers l’avant, puis replacez l’aiguille sur la ligne médiane pour marquer le site de perçage.
- Percez jusqu’à ce que la dure-mère soit identifiée sous l’os. Retirez délicatement les fragments d’os à l’aide d’une pince droite et remplissez la cavité de cire d’os.
- Percez un autre trou de 3 à 4 mm sur le côté droit du bregma et juste en avant de la suture coronale pour le laser-Doppler. Il n’est pas nécessaire de percer tout le chemin de l’os. Attention à ne pas pénétrer la dure-mère.
- Recherchez les vaisseaux où le laser-doppler peut mesurer le flux sanguin. Placez le laser-doppler et vérifiez les valeurs. Une valeur minimale de 100 FU est requise. Retirez le microscope (lumière artificielle).
- Si les valeurs sont toujours acceptables, ajoutez une goutte de colle pour fixer la sonde.
- Vérifiez à nouveau si la valeur est supérieure à 80 FU. Si la valeur est inférieure à 80 FU, retirez et repositionnez la sonde pour atteindre une valeur supérieure à 80 FU.
REMARQUE : La valeur, FU, est une unité arbitraire indiquant le débit sanguin cérébral (CBF).
6. Induction de l’hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA)
- Insérez doucement l’aiguille à travers le crâne sur la ligne médiane entre les hémisphères jusqu’à ce que la résistance de la base du crâne se fasse sentir. Rétractez l’aiguille de 1 mm pour assurer un placement correct juste avant le chiasma optique.
- Tournez l’aiguille de 90° dans le sens des aiguilles d’une montre de manière à ce que la pointe de l’aiguille pointe vers la droite pour assurer le résultat le plus homogène lors de l’injection du sang. Retirez le talon aiguille (Figure 1).
- Équilibrez pendant 15 minutes et ajustez le niveau d’anesthésie pour obtenir une pression artérielle moyenne comprise entre 80 et 100 mmHg.
- Effectuez une analyse des gaz du sang. Ajustez le niveau d’anesthésie en conséquence.
- Prélever 500 μL de sang du cathéter caudal à l’aide d’une seringue de 1 mL avec une aiguille émoussée de 23 G.
- Remplissez l’espace mort de la chambre de l’aiguille vertébrale avec du sang pour éviter l’injection d’air. Retirez l’aiguille de 23 g de la seringue remplie de sang et vérifiez que la seringue contient 300 μL de sang.
- Connectez la seringue à l’aiguille de la colonne vertébrale. Saisissez fermement et injectez le sang manuellement pour surpasser le MAP.
- Observez une forte hausse de l’ICP et une forte baisse du CBF sur le laptop.
note: La FCC doit être inférieure ou égale à 50 % par rapport au score de base pendant au moins 5 minutes pour que l’intervention chirurgicale réussisse, voir figure 2. Les rats fictifs ne subissent pas les étapes 6.1-6.7, omettant ainsi l’introduction de l’aiguille vertébrale dans le cerveau, minimisant ainsi les hémorragies spontanées possibles et les lésions cérébrales iatrogènes.
