Mesure de plusieurs paramètres mitochondriaux dans les neurones à l’aide de la cytométrie en flux

Abstract

Source : Liang, K. X., et al. Analyse cytométrique en flux de plusieurs paramètres mitochondriaux dans les cellules souches pluripotentes induites humaines et leurs dérivés neuraux et gliaux. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo démontre le marquage des cellules neuronales avec des anticorps pour les complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale, la protéine associée à l’ADN mitochondrial et la protéine de la membrane externe mitochondriale, suivi d’une cytométrie en flux pour quantifier leurs niveaux.

Protocol

1. Mesure par cytométrie en flux des sous-unités complexes MRC (chaîne respiratoire mitochondriale) et du TFAM (facteur de transcription mitochondrial A) dans les cellules fixes

1. À la fin de la période de culture, détachez les cellules (~10⁶) en ajoutant le réactif de dissociation cellulaire, puis granulez et recueillez les cellules dans un tube de 15 mL. Laver les cellules par centrifugation avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (1x) deux fois par centrifugation à 300 × g pendant 5 min.
2. Fixer les cellules dans du paraformaldéhyde à 1,6 % (PFA) (1 mL de PFA à 1,6 % dans un tube de 15 mL) à température ambiante (RT) pendant 10 min. Laver les cellules par centrifugation avec du PBS (1x) deux fois en centrifugeant à 300 × g pendant 5 min.
3. Perméabiliser les cellules avec du méthanol glacé à 90 % (1 mL de méthanol à 90 % dans un tube de 15 mL) à -20 °C pendant 20 min.
4. Bloquer les échantillons dans un tampon bloquant contenant 0,3 M de glycine, 5 % de sérum de chèvre et 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) - fraction V dans du PBS (1x) (1 mL de tampon bloquant dans un tube de 15 mL). Laver les cellules par centrifugation avec du PBS (1x) deux fois.
5. Incuber les cellules avec les anticorps primaires suivants pendant 30 minutes : anti-NDUFB10 (1:1 000) pour la mesure de la sous-unité du complexe I, sous-unité A du complexe anti-succinate déshydrogénase flavoprotéine (SDHA, 1:1 000) pour la mesure de la sous-unité du complexe II et anti-COX IV (1:1 000) pour la mesure de la sous-unité du complexe IV, et anticorps anti-TFAM (facteur de transcription mitochondrial A) conjugué à Alexa Fluor 488 (1:400). Colorer le même nombre de cellules séparément avec l’anticorps anti-TOMM20 (translocase de la membrane mitochondriale externe 20) conjugué à Alexa Fluor 488 (1:400) pendant 30 min (1 mL de solution d’anticorps primaire dans un tube de 15 mL ; voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur les anticorps).
6. Laver les cellules avec du PBS (1x) une fois avec centrifugation à 300 × g pendant 5 min. Ajouter l’anticorps secondaire (1:400) dans des tubes de NDUFB10, de SDHA et de COX IV et incuber les cellules avec ces solutions pendant 30 min.
7. Laver une fois les cellules avec du PBS (1x) par centrifugation à 300 × g pendant 5 min. Aspirer les surnageants en laissant environ 100 μL dans les tubes. Remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 300 μL de PBS (1x). Transférez les cellules dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL conservés dans l’obscurité sur de la glace.
8. Analysez les cellules sur le cytomètre en flux (avec une configuration laser 3 bleu et 1 laser). Détectez les signaux dans le filtre 1 (FL1) à l’aide d’un filtre passe-bande 530/30.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-TFAM conjugué à Alexa Fluor 488	Abcam	AB198308	Anticorps primaire ; utiliser sous forme de solution de coloration 1:400, 2,5 μL dans une solution de coloration de 1000 μL ; utilisez l’IgG2b monoclonal de souris Alexa Fluor® 488 comme contrôle d’isotype.
anti-TOMM20 conjugué avec Alexa Fluor 488	Biotechnologie de Santa Cruz	Cat# sc-17764 RRID :AB_628381	Anticorps primaire ; utiliser sous forme de solution de coloration 1:400, 2,5 μL dans une solution de coloration de 1000 μL ; utilisez l’IgG2a monoclonal de souris Alexa Fluor® 488 comme contrôle d’isotype.
anti-NDUFB10	Abcam	AB196019	Anticorps primaire ; utilisation sous forme de solution de coloration 1:1000, 1 μL dans une solution de coloration de 1000 μL ; utiliser Alexa Fluor ® 488 chèvre anti-lapin IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogue # A-11008) comme anticorps secondaire ; utiliser les IgG monoclonales de lapin comme contrôle isotype.
anti-SDHA	Abcam	AB137040	Anticorps primaire ; utilisation sous forme de solution de coloration 1:1000, 1 μL dans une solution de coloration de 1000 μL ; utiliser Alexa Fluor ® 488 chèvre anti-lapin IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogue # A-11008) comme anticorps secondaire ; utiliser les IgG monoclonales de lapin comme contrôle isotype.
anti-COX IV	Abcam	ab14744, RRID :AB_301443	Anticorps primaire ; utilisation sous forme de solution de coloration 1:1000, 1 μL dans une solution de coloration de 1000 μL ; utiliser les IgG anti-souris de chèvre Alexa Fluor ® 488 (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalogue # A-11001) comme anticorps secondaire ; utiliser des IgG monoclonales de souris comme contrôle d’isotype.
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Utilisé pour les étapes de lavage
Formaldéhyde (PFA) 16 %	Thermo Fisher Scientific	28908	Fixation cellulaire
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	Utilisé dans le tampon de blocage
Albumine sérique bovine	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	Agent bloquant pour empêcher la liaison non spécifique des anticorps dans les tests d’immunocoloration et l’ingrédient CDM