Toutes les procédures impliquant le prélèvement d'échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l'IRB de l'institut.
1. Mesure des signaux rapporteurs de la luciférase, qui correspondent au clivage de la γ-sécrétase de APP-C99 ( protéine précurseur amyloïde - fragment d’acide aminé C-terminal)
NOTE : Veuillez vous référer aux publications précédentes pour des descriptions détaillées de la génération des cellules CG (C99-Gal4).
- Implanter des cellules CG (20 000 cellules/puits) sur des microplaques à 96 puits à un volume final de 200 μL/puits dans un milieu de croissance composé de milieu d'aigle modifié de Dulbecco (DMEM) et de 10 % de sérum de bovin fœtal (FBS), de 5 μg/mL de blasticidine, de 250 μg/mL d'antibiotique (, par exemple , zéocine), et 200 μg/mL d’hygromycine B.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Transférez les microplaques dans un incubateur humidifié en CO2 et incubez à 37 °C pendant la nuit.
- Retirer 100 μL de milieu de croissance de chaque puits.
- Ajouter 100 μL/puits de milieu de croissance contenant 2 μg/mL de tétracycline avec 0,2 % de diméthylsulfoxyde (DMSO), 2 μM CL-387,785, 2 μM de n-[N-(3,5-difluorophénacétyl-L-alanyl)]-S-phénylglycine t-butylester (DAPT), ou d’autres inhibiteurs apparentés d’ErbB1/ErbB2.
- Incuber des cellules CG traitées dans des microplaques à 37 °C pendant 24 h.
- Retirer 150 μL/puits de milieu de croissance des microplaques.
- Ajouter 50 μL/puits de réactif de dosage de la luciférase (voir Table des matériaux).
- Transférez les microplaques dans un lecteur de microplaques à luminescence.
- Maintenez les microplaques à température ambiante pendant 5 min en les agitant doucement.
- Déterminez la luminescence émise par Firefly luciférase (FL) à l’aide d’un programme prédéfini stocké dans le lecteur de microplaques de luminescence.
