Immunohistochimie pour l’identification de la région du locus coeruleus dans des coupes de cerveau de souris

Résumé

Source : Schmidt, K. et al., Localisation du Locus Coeruleus dans le cerveau de la souris. J. Vis. Exp. (2019)

Ce protocole décrit l’utilisation de l’immunohistochimie pour identifier les régions du locus coeruleus dans des coupes de cerveau de souris. En ciblant la dopamine β-hydroxylase avec des anticorps marqués au fluorophore vert, les neurones producteurs de noradrénaline sont visualisés sous forme de fluorescence verte au microscope.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Trancher le cerveau

1. Pour immobiliser et anesthésier les souris par l’application de 3 % d’isoflurane.
   1. Imbibez une boule de coton de gouttes d’isoflurane et placez-la dans un tube de microcentrifugation de 15 ml. Placez le nez de l'animal dans le tube et laissez-le inhaler l'isoflurane. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réponse au pincement des orteils.
2. Placez l’animal sur le dos et immobilisez-le en épinglant ses extrémités avec une goupille en T tout en ayant accès à son abdomen.
3. Coupez l’animal avec des ciseaux chirurgicaux, en coupant la peau abdominale et en coupant la peau dans la région du thorax. Épinglez la peau vers le bas à l’aide d’épingles en T. Ensuite, cassez la membrane péritonéale jusqu’au thorax. Exposez le cœur en fissurant la cavité thoracique et en coupant le diaphragme.
4. Coupez l’oreillette droite pour permettre au sang de s’écouler de l’animal. Insérez une seringue de 10 ml avec une aiguille de calibre 25 dans le ventricule gauche et perfuser avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   REMARQUE : Cela permet à la solution de s’écouler par la circulation systémique et de sortir par l’oreillette droite.
5. Retirez la seringue de 10 ml et insérez une aiguille de calibre 25 fixée à la seringue de 60 ml. Perfuser dans le ventricule gauche avec 50 mL de paraformaldéhyde (PFA) glacé à 4 %.
   1. Préparez une solution glacée de PFA à 4 % en diluant une solution de PFA à 10 % dans H₂O et en refroidissant la solution finale de PFA à 4 °C.
6. Isolez la tête de la souris et retirez le cerveau du crâne.
   1. Coupez la peau du cou, puis coupez vers les yeux pour exposer le crâne. Cassez le crâne du cou vers le nez, puis d’un œil à l’autre. Retirez le crâne et excisez tout le cerveau.
7. Incuber le cerveau dans 4 % de PFA pendant 24 h à 4 °C.
8. Transférez le cerveau à l’aide d’une pince dans un tube conique de 50 ml rempli de 25 ml de solution de saccharose à 30 %. Maintenez-le à 4 °C pendant 48 à 72 heures jusqu’à ce que le cerveau coule au fond du tube.
9. Coupez le cerveau avec une matrice coronale de découpe de cerveau de souris adulte à travers le mésencéphale (~3 mm postérieur du bregma). Gardez la section du cerveau contenant le tronc cérébral.
   REMARQUE : Cela se traduira par deux sections cérébrales - l’une contenant la majeure partie du cortex (antérieur de l’incision) et l’autre contenant le tronc cérébral/cervelet (postérieur de l’incision). Utilisez la section du tronc cérébral pour les étapes suivantes.
10. Intégrez la section du tronc cérébral avec la surface coupée placée au fond d’un moule d’enrobage, entourée d’un composé à température de coupe optimale (OCT) ; Placez le cerveau intégré dans un congélateur à -80 °C et congelez-le pendant au moins 12 h - jusqu’à ce qu’il soit utilisé à nouveau.
11. Découpage au niveau du cryostat : placer le moule d’enrobage contenant le cerveau en OCT dans le cryostat ; L’incuber dans le cryostat pendant plusieurs heures pour ajuster la température du bloc cérébral à celle du cryostat.
12. Décollez le moule d’enrobage pour exposer le bloc OCT contenant le cerveau.
13. Utilisez des lames de rasoir pour éliminer l’excès d’OCT de la surface du bloc sans toucher le cerveau.
14. Montez le bloc OCT sur le mandrin du cryostat, exposant la surface coupée du cerveau vers l’avant.
15. Ajustez la surface coupée du cerveau de manière à ce qu’elle soit orientée parallèlement aux lames de rasoir du cryostat.
16. Coupez le cerveau en commençant par la moelle épinière, en coupant des sections de 100 μm par voie terrestre.
17. Coupez rostralement jusqu’à ce que le cervelet et le tronc cérébral soient coupés en une tranche continue. Commencez à collecter des tranches à 50 μm d’épaisseur.
    REMARQUE : Comme on coupe rostralement de la moelle, le tronc cérébral et le cervelet seront coupés en deux sections distinctes. Dans les sections rostrales, le tronc cérébral et le cervelet vont finir par fusionner au niveau du 4ème ventricule. Une fois que les bords latéraux du 4ème ventricule sont bien formés, le cervelet et le tronc cérébral sortiront en une seule tranche continue.
    1. Prélevez une tranche de cerveau entourée d’ECT à l’aide d’une pince et placez-la dans un puits d’une plaque à 24 puits remplie de PBS (Figure 1a). Le locus coeruleus (LC) sera le plus proéminent lorsque le cervelet et le colliculus inférieur se rencontrent à ~-5,52 mm en arrière du bregma (Figure 2b).
       REMARQUE : La partie la plus antérieure du LC disparaîtra une fois que le cervelet aura été complètement sectionné et n’entourera plus le colliculus inférieur à ~-5,34 mm en arrière du bregma (Figure 2c).

2. Immunohistochimie de la dopamine β-hydroxylase (DBH) ou de la tyrosine hydroxylase (TH) (Figure 1)

1. Jour 1
   1. Lavez les tranches sélectionnées trois fois pendant 5 min dans du PBS.
   2. Perméabiliser pendant 24 h dans une solution saline tamponnée au phosphate à 0,5 % avec un détergent (PBSD) à 4 °C.
      1. Diluer 125 μL de détergent dans 25 mL de PBS.
2. Jour 2
   1. Lavez les tranches trois fois pendant 5 minutes dans du PBSD à 0,5 %.
   2. Ajouter l’anticorps primaire, anti-DBH ou anti-TH, pendant 18 h à une dilution de 1:500 dans du PBSD à 0,5 % à 4 °C.
3. Jour 3
   1. Laver les tranches trois fois pendant 10 min dans du PBSD à 0,5 %.
   2. Ajouter l’anticorps secondaire souhaité (488 âne anti-lapin pour la fluorescence verte) à une dilution de 1:1000 dans 0,5 % de PBSD pendant 16 h.
   3. Enveloppez la plaque de 24 puits dans de l’aluminium et placez-la à 4 °C.
   4. Lavez les tranches trois fois pendant 5 minutes dans du PBSD à 0,5 %.
   5. Laver 5 min dans PBS.
   6. Transférez les tranches avec un pinceau crayon dans un récipient d’eau.
   7. Montez des tranches flottant dans l’eau sur des toboggans chargés.
   8. Sections de lamelles avec support de montage rigide Dopamine bêta-hydroxylase
   9. Faites sécher les sections de cerveau montées pendant 30 minutes à température ambiante.
   10. Imagez des coupes cérébrales à l’aide d’un microscope confocal ou fluorescent avec des réglages permettant de détecter les signaux provenant de la longueur d’onde du fluorophore des anticorps secondaires appropriée.
   11. Ajustez le microscope au plan focal de la tranche de cerveau et prenez une seule image avec un grossissement de 10X.

Résultats

Figure 1 : Détection de la LC par immunomarquage de coupes de cerveau pour DBH ou TH. (a) Le cerveau d’une souris a été sectionné en tranches de 50 μm autour du tronc cérébral et collecté dans deux boîtes de 24 puits. Chaque tranche de cerveau prélevée sur 5 à 8 a été montée sur une lamelle recouverte d’un film pour l’imagerie via XFM. Ces tranches sont étiquetées avec des chiffres bleus entre les p...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Matrice de découpage de cerveau de souris adulte	Zivic Instruments	BSMAS001-1
Anticorps secondaire anti-lapin, Alexa Fluor 488 (source - âne)	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Lames de verre chargé	Genesee	29-107
Microscope confocal	Zeiss	LSM 800
Cryostat	Microm GmbH	HM 505E
Lames de coupe cryostat	Thermo Fisher Scientific	MX35
Ciseaux Mini, 9,5cm	Antech Diagnostcs	503241
DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole)	Sigma-Aldrich	D9542-10MG
Anticorps anti-dopamine β-hydroxylase (DBH) - production interne (source - lapin)	B. Eipper	-
Anticorps anti-dopamine β-hydroxylase (DBH) - disponible dans le commerce (source - lapin)	Signalisation cellulaire	8586
Tubes Falcon, 50ml	États-Unis Scientific	339652
Forane (isofluorane)	Baxter	NDC 1019-360-60
Pince Micro Adson	Antech Diagnostcs	501245
Support de montage Hardset	EM sciences	17984-24
Microscope	Pascal	LSM 5
Plaques multi-puits, 24 puits	Thermo Fisher Scientific	930186
Température de coupe optimale (OCT)	VWR/ technologie tissulaire	102094-106
Paraformaldéhyde (PFA)/ formol 10 %	Fisher Scientific	SF98-4
Moules d’enrobage jetables Peel-A-Way	Polysciences Inc.	18646A
Pinceau crayon
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	Technologie de la vie	14190250
Lames de rasoir	Amazone	ASIN : B000CMFJZ2
Spatules	Antech Diagnostcs	14374
Broches en T	Dépôt de bureau	344615
Le cerveau de souris en coordonnées stéréotaxiques, Paxinos et Franklin, 3e édition	Amazone	Numéro ISBN : 978-0123694607
Triton-X 100 (pour préparer le PBSD)	Sigma-Aldrich	Réf. T8787
Préadolescent 20	Sigma-Aldrich	P7949-500ml
Anticorps anti-tyrosine hydroxylase (TH) (source - lapin)	EMD Millipore	AB152
Microscope fluorescent à grand champ	Zeiss	Axio Zoom.V16