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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Procédure pré-chirurgicale
- Avant de commencer l’opération, essuyez le tout avec de l’éthanol à 70 % pour maintenir des conditions stériles. Il est recommandé d’utiliser un coussin chauffant à l’aide d’un coussin chauffant.
- Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale d’hydrate de chloral (400 mg/kg). L’utilisation de méloxicam SR lors de l’induction et de buprénorphine dès le rétablissement deux fois par jour (bis in die, deux fois par jour) pendant au moins 24 h est recommandée.
- Rasez les cheveux avec une tondeuse chirurgicale. Fixez une souris dans l’adaptateur souris et rat nouveau-né à l’aide de barres d’oreille et d’une pince nasale.
NOTE : Il est essentiel de s’assurer que la tête de la souris est sécurisée à ce stade et ne se déplace pas côte à côte.
- Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
2. Chirurgie stéréotaxique pour l’implantation d’une canule guide
- Réglez l’adaptateur souris et rat nouveau-né sur l’appareil stéréotaxique. Faites une incision sagittale sur la peau au-dessus du crâne à l’aide d’un scalpel. Essuyez le sang et le tissu conjonctif du crâne à l’aide d’un coton-tige humide.
- Déterminez les coordonnées de la région cérébrale d’intérêt à l’aide de l’atlas cérébral. Avant de commencer les mesures, assurez-vous que la ligne médiane est droite afin que le foret puisse être déplacé de A à P et rester sur la suture médiane tout le temps.
REMARQUE : Cet article utilise la coordonnée (A/P : -3,1 mm, M/L : -2,5 mm, D/V : -1,2 mm, 12 degrés) pour cibler l’hippocampe postérieur.
- Niveau crâne A-P
- Fixez une perceuse sur un manipulateur d’un cadre stéréotaxique. Abaissez la perceuse jusqu’à ce qu’elle touche doucement lambda et enregistrez ses coordonnées ventrales. Répétez cette procédure pour bregma.
NOTE : Lorsque le crâne est nivelé, la mesure verticale de bregma est égale à celle de lambda. Si ce n’est pas le cas, ajustez la hauteur du collier de nez en conséquence. Une fois le crâne nivelé, notez les coordonnées latérales antérieures/postérieures du bregma.
- Niveau crâne gauche-droite
- Déplacez la perceuse du bregma vers la coordonnée (antéropostérieure [A/P] : -3,1 mm, médiolatérale [M/L] : +2,0 mm), abaissez la perceuse jusqu’au crâne et notez la coordonnée verticale. Répétez ensuite cette procédure pour les coordonnées (A/P : -3,1 mm, M/L : -2,0 mm).
REMARQUE : Si le crâne est nivelé, ces mesures verticales de deux points équidistants de la ligne médiane sont égales. Sinon, ajustez la hauteur des barres d’oreille.
- Percez soigneusement un trou de bavure à la coordonnée cible (A/P : -3,1 mm, M/L : -2,5 mm) pour implanter une canule de guidage. Si le diamètre d’un trou de fraise n’est pas assez grand pour l’implantation d’une canule de guidage, percez un autre trou qui chevauche le premier. Percez un autre trou sur l’os pariétal droit (côté controlatéral) et insérez une vis à os, ce qui aide à fixer le ciment dentaire en 1.10 (Voir Figure 1B).
- Coupez un morceau de verrouillage circulaire à l'arrière du couvercle d'un tube à centrifuger de 1,5 mL à l'aide d'une lame de rasoir et faites une « couronne ». Cette couronne est utilisée pour empêcher le ciment dentaire de se propager à la peau. Placez-le sur le crâne de manière à ce que les trous de bavure faits à l’étape 2.5 restent à l’intérieur du cercle (Voir Figure 1).
- Installez un ensemble stéréotaxique en plaçant une canule de guidage sur le bras le plus court d’un adaptateur stéréotaxique et fixez-le à l’aide d’un écrou borgne. Placez le bras le plus long de l’adaptateur stéréotaxique sur la pince d’électrode. Fixez-le sur le manipulateur de l’appareil stéréotaxique (Voir Figure 1A).
- Faites pivoter l’ensemble stéréofiscal dorsal-ventral (D-V) sur le bras manipulateur de 12 degrés (voir Figure 1B). Déplacez la canule de guidage vers le trou de fraise réalisé en 1.6. Insérez lentement la canule guide dans le cerveau en l’abaissant de 1,2 mm.
REMARQUE : L’angle de la sonde est spécifique à l’hippocampe ; D’autres régions peuvent nécessiter d’autres angles ou aucun angle. Consultez un atlas cérébral pour obtenir des coordonnées précises. Séchez la surface du crâne, car si ce n’est pas le cas, le ciment ne collera pas et le capuchon de ciment peut se déloger
- Ajoutez le ciment dentaire à l’intérieur de la couronne pour couvrir entièrement la partie métallique de la canule de guidage et la vis à os suffisamment pour les fixer. Appliquez du ciment dentaire supplémentaire s’il y a une partie du crâne exposée.
- Attendez que le ciment dentaire soit complètement sec (~12-20 min). Retirez l’adaptateur stéréotaxique de la pince d’électrode. Retirez l’écrou borgne et remplacez l’adaptateur stéréotaxique par une sonde factice et fixez l’écrou borgne.
- Libérez la souris de l’appareil stéréotaxique et logez-la seule dans une cage individuelle.
REMARQUE : La souris ne doit pas être laissée sans surveillance jusqu’à ce qu’elle ait repris suffisamment conscience pour maintenir le décubitus sternal. Vérifiez la souris tous les jours jusqu’au jour de la microdialyse. La souris reçoit des anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) tels que le carprofène si elle semble souffrir. Il est nécessaire d’attendre 2 semaines pour les études veille-sommeil afin que la souris s’habitue au nouvel environnement, mais d’autres types d’études peuvent nécessiter des périodes de récupération plus courtes (e.g., 1-2 jours).
3. Configuration de la microdialyse
- Contrôle de la qualité des sondes : Remplissez une seringue jetable de 1 ml avec de l’eau distillée et connectez-la à la sortie (port plus court) d’une sonde à l’aide d’un tube byton. Couvrez les trous d’aération avec les doigts et appuyez doucement sur le piston de la seringue pour infuser de l’eau dans la sonde. Vérifiez que de l’eau apparaît de l’entrée de la sonde et qu’il n’y a pas de fuite à la surface d’une membrane de microdialyse.
- Activation des sondes : Immergez les membranes d’une sonde dans de l’éthanol (70-100 %) pendant deux secondes. Ensuite, infusez à nouveau de l’eau distillée dans la sonde à l’aide d’une seringue.
- Préparation du tampon de perfusion : Afin d’éviter l’adhésion des molécules cibles aux tubulures, ajouter du BSA en diluant une solution de BSA à 30 % à 4 % avec du liquide céphalo-rachidien artificiel (aCSF : 1,3 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 25 mM NaHCO3, 122 mM NaCl, pH=7,35), ce qui correspond étroitement à la concentration d’électrolytes dans le LCR, immédiatement avant l’utilisation. Filtrez le tampon de perfusion à travers une unité de filtre à seringue avec une taille de pores de 0,1 μm.
REMARQUE : 4 % d’albumine sérique bovine (BSA) améliore la récupération des protéines collantes mais peut limiter sévèrement l’administration de composés, en particulier pour les composés qui ont une liaison BSA élevée. C’est l’un des avantages de l’utilisation d’une concentration plus faible de BSA (comme 0,15 %) dans certains cas. Notez que les BSA peuvent s’agréger très facilement lorsqu’ils sont agités par vortex ou plaque d’agitation. Ces agrégats peuvent obstruer les sondes ou les pores de la membrane. Soyez prudent lors de la préparation d’une solution BSA pour limiter cette agrégation
- Préparez deux conduites distinctes pour l’entrée et la sortie (voir Figure 1C) et connectez les deux conduites à l’aide d’une aiguille de connexion. Remplissez une seringue jetable de 3 ml remplie d’un tampon de perfusion et reliez-la à l’extrémité d’entrée de la tubulure à l’aide d’une aiguille à bout émoussé. Remplissez toute la tubulure avec un tampon de perfusion en faisant fonctionner le pousse-seringue.
- Arrêtez le pousse-seringue et remplacez l’aiguille de raccordement entre la conduite d’entrée et la conduite de sortie par une sonde de microdialyse activée à l’étape 3.3 (voir Figure 1C). Avant ce remplacement, mettez l’écrou borgne sur la sonde.
- Montez le tube du rouleau dans le tube de sortie de la pompe à rouleau. Démarrez la pompe à seringue à 10 μL/min, puis la pompe à rouleaux au débit légèrement plus lent (9,5-9,8 μL/min). Assurez-vous d’éliminer toutes les bulles d’air dans l’ensemble du tube, qui peuvent influencer la récupération lorsqu’elles pénètrent dans la sonde.
- Anesthésie la souris à partir de l’étape 1.12 de la même manière qu’à l’étape 1.2. Mettez le collier de souris autour de son cou. Retirez l’écrou borgne et la sonde factice et insérez lentement une sonde de microdialyse de 3,4 à travers la canule de guidage et fixez l’écrou borgne.
- Placez la souris dans la cage reliée à un système mobile et attachez la souris avec le collier. Continuez à faire fonctionner la pompe à seringue et la pompe à rouleaux au débit indiqué à l’étape 3.5 pendant au moins 1 h.
REMARQUE : Pour réaliser la collecte ISF sur des animaux éveillés, cet article utilise un système de mouvement libre, où la cage elle-même répond au mouvement d'un animal pour empêcher les tubes de se tordre. Alternativement, des émerillons à liquide disponibles auprès de différentes entreprises peuvent également être utilisés.
- Arrêtez d’abord la pompe à rouleau, puis la pompe à seringue. Réglez le débit souhaité. Faites fonctionner la pompe à seringue 20 % plus vite que la pompe à rouleau.
REMARQUE : Par exemple, si vous utilisez à 1 μL/min, faites fonctionner le pousse-seringue à 1,2 μL/min. Le débit optimal doit être déterminé empiriquement pour chaque molécule.
- Prélèvement des échantillons ISF : placer l’extrémité libre du tube de sortie sur le collecteur de fractions réfrigéré.
REMARQUE : Le volume d’échantillon approprié varie en fonction des dosages utilisés pour l’analyse.
- Une fois l’expérience terminée, retirez la sonde (anesthésiez la souris au besoin).Gérez la récupération de la souris de la même manière qu’à l’étape 2.11. Analysez l’ISF collecté par des méthodes telles que la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) ou le test immuno-enzymatique (ELISA).
- Pour laver tout le tube après la microdialyse, raccordez les tubes d’entrée et de sortie en remplaçant la sonde par l’aiguille de raccordement et faites couler l’eau de Javel diluée dans tout le tube, puis rincez-le à l’eau. Séchez-le et rangez-le pour une utilisation répétée.
REMARQUE : D’autres types de tubes sont acceptables, cependant, le BSA dans le tampon de perfusion peut obstruer les tubes de petit diamètre, donc ces tubes sont considérés comme à usage unique. Les tubes peuvent être usés ou obstrués après plusieurs utilisations, alors assurez-vous que le débit est constant à chaque fois avant utilisation.
