Modèle d’invasion tumorale basé sur la matrice utilisant la co-culture de glioblastome de microglie

Résumé

Source : Coniglio, S., et al. Essais de coculture pour étudier la stimulation des macrophages et de la microglie de l’invasion du glioblastome. J. Vis. Exp. (2016)

Dans cette vidéo, des cellules de glioblastome et de microglie sont mélangées à une solution de matrice polymère et transférées dans une chambre poreuse où un gel se forme, intégrant les cellules. La microglie stimule la migration des cellules de glioblastome à travers l’insert poreux, imitant l’invasion des cellules tumorales dans les tissus environnants, les cellules sont ensuite fixées et préparées pour une analyse plus approfondie.

Protocole

1. Marquage fluorescent des cellules

REMARQUE : Étiquetez les lignées cellulaires de glioblastome et la microglie avec des colorants fluorescents 9. Alternativement, générer des lignées cellulaires qui expriment constitutivement des protéines fluorescentes telles que GFP / RFP.

1. Plaquez les cellules sur une plaque à 6 puits de sorte qu’elles soient confluentes à 70 à 80 % le jour de la coloration. Pour la lignée cellulaire de glioblastome murin GL261 et la lignée cellulaire de glioblastome humain U87, plaque 1 x 10⁶ et 1,5 x 10⁶, respectivement, sur une boîte de 6 cm 24 heures avant la coloration.
2. Préparez une solution de colorant cellulaire fluorescent dans du DMSO (sulfoxyde de diméthyle) et ajoutez un colorant de 5 μM dans le milieu, soit le milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ou le milieu libre de sérum de macrophage (MSFM), bien vortex.
3. Incuber les cellules avec un colorant pendant 30 min à 37 °C et 5 % de CO₂.
4. Retirez le milieu contenant du colorant et ajoutez un nouveau milieu (RPMI ou MSFM) dans les cellules.
5. Incuber les cellules pendant 30 min. Remarque : Les cellules sont maintenant colorées et prêtes à être utilisées dans l’expérience.

2. Essai d’invasion « 3D » intégrant le gliome et les macrophages/microglies dans la matrice

1. Décongeler le mélange matriciel à 4 °C pendant la nuit. Effectuez toutes les manipulations ultérieures à l’aide d’une matrice sur glace dans le capot.
2. Préparer une concentration de 10 mg/ml de matrice dans un milieu (MSFM ou RPMI) avec 0,3 % de BSA sur glace.
   REMARQUE : La concentration de stock de la matrice est généralement d’environ 15 mg/ml.
3. Pour préparer les cellules (marquées à l’étape 1) à la suspension dans la matrice, prélevez les milieux des cellules par aspiration. Laver les cellules sur une coupelle avec 2 mM d’EDTA (acide éthylènediamine tétraacétique)/PBS (solution saline tamponnée au phosphate). Ajouter 500 μl de 2 mM D’EDTA/PBS dans les cellules et incuber pendant 5 à 10 min à 37 °C et 5 % de CO₂.
4. Mettre les cellules en suspension dans 5 ml de milieu contenant 0,3 % de BSA.
5. Centrifugeuse pendant 5 min à 120 x g.
6. Aspirez le surnageant de la pastille. Mettre la pastille en suspension dans un milieu/BSA à 0,3 % de telle sorte que la concentration de cellules soit égale à 1 x 10⁶ cellules/ml. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules.
7. Ajoutez 1,5 x 10⁵ cellules GL261 (dans 150 μl) + 5 x 10⁴ cellules microgliales (dans 50 μl) dans un tube microfuge de 1,5 ml. Ajoutez 2 cellules GL261 de 10⁵ (200 μl) dans un tube de microfuge séparé de 1,5 ml.
   REMARQUE : Les cellules GL261 seules sans microglie servent de contrôle.
8. Spinchez les cellules dans un microfuge pendant 5 min à 120 x g.
9. Remettre en suspension les cellules dans une matrice froide de 200 μl sur de la glace.
10. Plaquez 50 μl (50 000 cellules) au centre du compartiment supérieur de l’insert de chambre de taille de pores de 8 μM.
11. Incuber à 37 °C pendant 30 min pour que la polymérisation se produise.
12. Ajoutez 200 μl de milieu sans sérum dans la chambre supérieure et 700 μl de milieu de croissance cellulaire contenant du sérum dans le puits inférieur.
13. Incuber à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 48 h.
14. Après l’incubation, retirez les cellules du haut de la chambre par aspiration douce et fixez les chambres en les plaçant dans du formaldéhyde à 3,7 % dans du PBS. Laisser les chambres dans le fixateur pendant 15 minutes à température ambiante (ou toute la nuit à 4 °C). Retirer le fixateur par aspiration douce et le remplacer par 500 μl 1x PBS. Passez à la section 4 pour l’analyse de l’image.

Résultats

Graphique 1 : Schéma de deux protocoles différents pour le dosage de l’invasion cellulaire du glioblastome stimulé par la microglie et les macrophages. Le panneau supérieur illustre le test d’invasion de la chambre matricielle pré-revêtue. Le panneau inférieur illustre le test d’invasion matricielle 3D.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chambre d’invasion Corning BioCoat Matrigel : avec matrice BD Matrigel	Corning/Fisher Scientific	Catalogue : 354481
Milieu sans sérum de macrophage (MSFM) (500 ml)	Technologies de la vie	12065-074
Colorant CellTracker Rouge CMTPX	Technologies du Vivant/Sondes Moléculaires	Réf. C34552
CellTracker Colorant CMFDA vert	Technologies du Vivant/Sondes Moléculaires	Réf. C2925
Lignée cellulaire GL261	Institut national du cancer (NCI)
Lignée cellulaire THP-1	Collection de cultures de types de tissus américains	ATCC TIB-202
RPMI 1640 Moyen (500 ml)	Life Technologies/Gibco	11875-093
Solution de formaldéhyde	Sigma Aldrich	F1635
Inserts de culture cellulaire à membrane en polycarbonate Corning Transwell (pore de 8 μM) 48 par paquet.	Corning	CLS3422
Matrice de culture Cultrex 3D Facteur de croissance réduit Extrait de membrane basale, PathClear	Trevigen	3445-005-01
Sérum de veau fœtal (FBS)	Technologies de la vie	Cat : 10500064
Albumine sérique bovine, fraction V, traitée par choc thermique	Fisherscientific	BP1600-100
0,5 million d’EDTA	ThermoFisher Scientific	15575-020