Infection par le virus Zika des cellules souches neurales fœtales

Résumé

Source : McGrath, E. L., et al., Infection par le virus Zika de cellules souches neurales de cerveau fœtal humain cultivé pour l’analyse immunocytochimique. J. Vis. Exp. (2018)

Cette vidéo montre une procédure permettant d’infecter des cellules souches neurales fœtales humaines avec le virus Zika. Les cellules infectées peuvent être utilisées pour d’autres études.

Protocole

1. Infection par le virus Zika

REMARQUE : Le ZIKV est très sensible à la température, il est donc impératif que le stock de ZIKV soit stocké à -80 °C et que les cycles de gel/dégel soient évités. Continuez à travailler les aliquotes sur la glace.

1. Cellules de passage. 3 à 4 millions de cellules au total sont nécessaires pour ensemencer une plaque de 24 puits, donc lors du passage, mettez le nombre de cellules nécessaires pour l’infection et l’ensemencement dans un flacon lors du passage.
2. Si vous ensemencez des cellules dans une plaque à 24 puits pour la coloration, préparez la plaque [Enduire les puits contenant des lamelles de recouvrement avec 0,01 % de poly-D-lysine (PDL) dans de l’eau stérile et incuber pendant 1 h à 37 °C. Pour une plaque de 24 puits, utilisez 250 μL de PDL par puits].
3. Après le passage, placer 1 mL de suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifuger à 200 x g à température ambiante pendant 5 min. Ensuite, retirez le surnageant par aspiration.
4. Remettre en suspension les pastilles cellulaires dans le stock de virus Zika pour acquérir une multiplicité d’infection (MOI) de 1 à 10. Le volume de la solution de virus Zika ne doit pas dépasser 0,5 mL. Pour le traitement simulé (cellules témoins), remettre les cellules en suspension dans le même volume et le même type de milieu que ceux utilisés dans le stock ZIKV.
5. Incuber au-dessus du mélange cellule/VZIK à 37 °C pendant 1 h. Retournez le tube 2 à 3 fois, puis centrifugez le mélange pendant 5 min à 216 x g à température ambiante pour obtenir une pastille de cellule. Remettre la pastille en suspension dans le dPBS et centrifuger à nouveau pendant 5 min à 216 x g à température ambiante.
6. Retirer le surnageant par aspiration, remettre les cellules en suspension avec un milieu approprié et charger les cellules infectées dans le ballon ou la plaque nécessaire à l’expérience. Si vous ensemencez les cellules dans une plaque à 24 puits, remettez la pastille en suspension dans 12 mL de milieu approprié, puis ajoutez 500 μL de suspension dans chaque puits.
   REMARQUE : À ce stade, soit maintenir les cellules dans des milieux de croissance pour observer les effets du ZIKV sur les cellules souches, soit passer aux étapes 6 ou 7 pour étudier l’effet du ZIKV sur le processus de différenciation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	Gibco	11965-092
F12	Gibco	11765-054
Glucose (10 %)	Sigma	G8644
HEPES (1M)	Corning/cellgro	25-060-c1
Streptocoque stylo (100x)	Gibco	15140-122
Incubateur de dioxyde de carbone	Thermo Forma	Modèle# 3110
Centrifugeuse	Thermo fisher Scientific	75004221
Bureau de sécurité biologique	Forma scientific Claas II A/B3	Modèle# 1284
Bromhydrate de poly-D-lysine (PDL)	Sigma	P6407-5MG
Laminine	Invitrogen	23017-015