Étude de la transmigration lymphocytaire à travers une monocouche de cellules endothéliales microvasculaires

Résumé

Source : Schulte-Mecklenbeck, A., et al., Analyse de l’extravasation lymphocytaire à l’aide d’un modèle in vitro de la barrière hémato-encéphalique humaine. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo présente une étude expérimentale de la transmigration des lymphocytes à travers un modèle d’endothélium de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Une monocouche de cellules endothéliales microvasculaires du cerveau humain (HBMEC) est générée in vitro, et des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) contenant des lymphocytes sont ajoutées à la monocouche. Les cellules sont ensuite incubées pour permettre la transmigration des lymphocytes, et les cellules migrées sont quantifiées par cytométrie en flux.

Protocole

1. Préparation des inserts de culture cellulaire

1. Revêtement d’inserts de culture cellulaire
   Remarque importante : Évitez de toucher la membrane des inserts de culture cellulaire.
   1. Ajouter 100 μL de solution de fibronectine dans chaque insert de culture cellulaire (Figure 1A) et un puits d’une plaque à fond plat à 96 puits (puits de contrôle optique). Incuber pendant au moins 3 h à 37 °C. Après l’incubation, aspirez la solution de fibronectine.
   2. Ajoutez une suspension HBMEC de 100 μL aux inserts de culture cellulaire et au puits de contrôle optique. Ajouter 600 μl de milieu cellulaire endothélial-basal (ECM-b) dans le compartiment inférieur des inserts de culture cellulaire. Incuber pendant 3 à 4 jours à 37 °C / 5 % CO₂ jusqu’à ce que l’intégrité de la barrière (Figure 1B) soit atteinte, vérifier la croissance cellulaire par évaluation microscopique du HBMEC dans le puits de contrôle optique.
      Remarque : La croissance cellulaire au-delà de quatre jours n’est pas recommandée.

2. Test de migration

1. Préparation de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC).
   1. Ajouter 10 ml de milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) dans un tube à centrifuger de 15 ml et ajouter un supplément de 200 μL de B27. Compter les cellules PBMC et centrifugeuses à 300 x g pendant 5 min. Remettre en suspension la PBMC jusqu’à une concentration finale de 5 x 10⁶ cellules/mL de RPMI/B27.
2. Mise en place de l’essai de migration
   1. Aspirer le milieu à partir du compartiment inférieur suivi du compartiment supérieur des inserts de culture cellulaire contenant des monocouches HBMEC confluentes (Figure 1A). Par donneur, ajouter 100 μL de suspension PBMC chacun dans les inserts de culture cellulaire et également dans un puits d’une plaque de 24 puits par ( in vitro }contrôle).
   2. Ajouter 600 μL de RPMI/B27 dans le compartiment inférieur des inserts de culture cellulaire et 500 μL dans le PBMC du contrôle in vitro et incuber 6 h à 37 °C / 5 % CO_2.
3. Récolte des PBMC migrés
   1. Retirez l’insert de culture cellulaire à l’aide d’une pince et rincez soigneusement le fond avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 400 μL sans toucher la membrane. Jetez l’insert de culture cellulaire.
   2. Ajouter des fluorosphères de 20 μL (environ 1 000 billes/μL) au compartiment inférieur de l’insert de culture cellulaire ainsi qu’au témoin in vitro et bien mélanger. Transférez 1 mL de la suspension PBMC obtenue dans des tubes de cytométrie en flux.

3. Cytométrie en flux

1. Préparation des échantillons
   1. Centrifugeuse PBMC à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
   2. Préparez la solution d’anticorps en ajoutant des anticorps conjugués au fluorochrome dans un tampon de cytométrie en flux de 100 μL (PBS/albumine sérique bovine à 1 % [BSA]/2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique [EDTA]) par échantillon. Pour les résultats présentés ci-dessous, 1 μL de CD4-FITC (groupe de différenciation de l’isothiocyanate de 4-fluorescéine), 1 μL de CD3-PerCP/Cy5.5 (protéine de chlorophylle de péridinine/cyanine 5,5), 1 μL de CD56-PC7 (phycoérythrine cyanine 7), 1 μL de CD8-A700 (Alexa fluor 700) et 1 μL de CD16-A750 (Alexa fluor 750) ont été utilisés par échantillon.
   3. Remettre en suspension le PBMC dans 100 μL de la solution d’anticorps et incuber pendant 30 min à 4 °C.
   4. Ajouter un tampon de cytométrie en flux de 250 μL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.

Résultats

Figure 1 : Migration différentielle de sous-ensembles de cellules NK à travers des monocouches HBMEC non enflammées et enflammées.Une image des inserts de transpuits (à gauche) et une illustration du dispositif expérimental (à droite). B. Validation des fonctions de barrière HBMEC. A gauche : coloration immunohistochimique de la molécule de jonction serrée ZO-1 à l’aide de zon...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
PBS	Gibco	14190-094	sans CaCl2 ou MgCl2
Fibronectine 1mg/mL	Sigma	F1141-5MG	à partir de plasma bovin
HBMEC	ScienCell	1000
HBMEC	Pelobiotech	PB-H-6023
ECM-b	ScienCell	1001-b
FBS	ScienCell	1001-b
Pénicilline/Streptomycine	ScienCell	1001-b
Supplément de croissance des cellules endothéliales	ScienCell	1001-b
Transwell	Corning	3472	clair, diamètre de 6,5 mm, taille de pores de 3,0 μm
Plaque à fond plat à 96 puits	Corning	3596
B27	Gibco	17504-044	50x concentré
Plaque à 48 puits	Corning	3526
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Nombre de flux de fluorosphères	Beckman Coulter	7547053
Na-EDTA	Sigma	E5134
BSA	Sigma	A2153
CD3-PerCP/Cy5.5	Biolégende	300430	clone UCHT1
CD56-PC7	Beckman Coulter	A21692	clone N901
CD16-A750	Beckman Coulter	A66330	clone 3G8
CD4-FITC	Biolégende	300506	clone RPA-T4
CD8-A700	Beckman Coulter	A66332	clone B9.11