Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Détermination de la zone d’infarctus
- Mesurez la zone d’infarctus (IZ) 24 heures après l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAO).
NOTE : Les rats qui ont perdu plus de 20 % de leur poids ou qui ont développé des convulsions ou une hémiplégie sont exclus de l’expérience.
- Euthanasiez le rat en remplaçant le mélange gazeux inspiré par 20 % d’oxygène et 80 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce que le rat cesse de respirer spontanément.
- Ouvrez la poitrine avec une incision latérale de 5 à 6 cm à travers la paroi abdominale sous la cage thoracique à l’aide de ciseaux et de pinces chirurgicales.
- Effectuez une incision diaphragmatique sur toute la longueur de la cage thoracique avec des ciseaux et une pince chirurgicale.
- En déplaçant soigneusement les poumons, coupez à travers la cage thoracique jusqu’à la clavicule sur les côtés droit et gauche.
- Perfuser avec 200 mL de solution saline normale par le ventricule gauche du cœur.
- Percer ou inciser l’oreillette droite du cœur avec des ciseaux.
- Effectuez la décapitation à l’aide d’une guillotine et prélevez du tissu cérébral.
- À l’aide de ciseaux à iris, coupez du foramen magnum jusqu’au bord distal de la surface postérieure du crâne des deux côtés.
- Séparez les bulbes olfactifs, les connexions nerveuses le long de la surface ventrale et de la surface dorsale du crâne du cerveau.
- Retirez le cerveau de la tête.
- Produisez 6 tranches de cerveau en créant des sections horizontales de 2 mm d’épaisseur avec une lame de rasoir en acier inoxydable de 0,009 po, non revêtue, à un seul tranchant.
- Incuber pendant 30 min à 37 °C à 0,05 % TTC.
- Placez le tissu cérébral sur les lames de microscope et effectuez un balayage optique de ces 6 tranches de cerveau avec une résolution de 1600x1600 dpi (voir Figure 1 par exemple).
- Ajoutez un filtre bleu avec un éditeur de photos (par exemple, Adobe Photoshop CS2) à l’aide de la fonction Mélangeur de canaux (Ajustements de > d’images > Mélangeur de canaux) et enregistrez l’image au format de fichier JPEG.
REMARQUE : Après avoir appliqué le filtre bleu, l’image apparaîtra en niveaux de gris.
- Ouvrez l’image enregistrée dans ImageJ 1.37v.
REMARQUE : Ce programme informatique utilise une fonction de seuil pour isoler et calculer les pixels qui sont soit noirs, soit blancs (voir Figure 2).
- Pour chacune des 6 tranches cérébrales de l’image, sélectionnez et enregistrez chaque hémisphère (ipsilatéral blessé à droite et controlatéral non blessé à gauche) dans un fichier image séparé à l’aide de l’outil « sélection de polygones » du menu principal.
- Définissez la limite pour déterminer IZ à l’aide d’une fonction de seuil automatique dans le menu principal du logiciel ImageJ en sélectionnant Image > Ajuster > seuil et mesurez le nombre de pixels dans chaque hémisphère d’un seul ensemble de cerveaux.
REMARQUE : Les macros peuvent être utilisées pour cette étape dans le logiciel ImageJ (voir Document supplémentaire 1 pour le code). La coupure est un paramètre critique pour déterminer quels pixels convertir en blanc et lesquels convertir en noir en fonction de la nuance de gris (voir Figure 3 et Figure 4 à titre d’exemples). ImageJ compare ensuite les pixels blancs et noirs pour déterminer la IZ. Sur la base du protocole de coloration et des paramètres du scanner, nous avons utilisé une valeur de coupure constante de 0,220.
- Effectuer la mesure de la correction de la ZI pour le gonflement des tissus à l’aide de la méthode RICH (Ratios of Ipsilateral and Conlateral Cerebral Hemispheres) (voir exemple dans Figure 5).
REMARQUE : La taille de l’infarctus est évaluée en pourcentage de l’hémisphère controlatéral.
2. Détermination de l’œdème cérébral
REMARQUE : Utilisez ImageJ 1.37v pour la mesure de l’œdème cérébral (BE).
- Mesurez BE 24 h après MCAO. Pour le calcul de l’EB, utilisez les données du volume des hémisphères gauche et droit (en unités).
- Effectuez un balayage optique avec une résolution de 1600x1600 dpi (voir Figure 1 par exemple).
- Sélectionnez les hémisphères cérébraux et réglez le seuil pour déterminer l’EB avec ImageJ 1,37v, comme décrit ci-dessus dans les sections 1.17-1.19.
- Exprimer l’aire BE en pourcentage des aires standard de l’hémisphère controlatéral non affecté, calculée par la méthode RICH à l’aide de l’équation suivante (voir exemple dans Figure 5).
REMARQUE : L’étendue de l’EB est évaluée en pourcentage de l’hémisphère controlatéral.
