Évaluation de la résistance électrique transendothéliale dans un modèle in vitro de barrière hémato-encéphalique

Résumé

Source : Kuzmanov, I., et al. Un modèle in vitro de la barrière hémato-encéphalique à l’aide de la spectroscopie d’impédance : un focus sur l’interaction lymphocytes T-cellules endothéliales. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo présente une méthode d’évaluation de la résistance électrique transendothéliale (TEER) dans les cellules endothéliales microvasculaires du cerveau de souris in vitro. Une valeur TEER élevée indique des jonctions de cellules endothéliales intactes, tandis que l’ajout de cellules T activées abaisse la valeur TEER, reflétant une perturbation de la barrière jonctionnelle.

Protocole

1. Configuration et réalisation de la mesure de la résistance électrique transendothéliale (TEER)

1. Placez le module à 24 puits de l’instrument de résistance électrique transendothéliale (TEER) sous la hotte à flux laminaire. Retirez les couvercles et placez les inserts avec des cellules endothéliales microvasculaires microvasculaires (MBMEC) primaires du cerveau de souris dans l’instrument à l’aide d’une pince.
2. Pipette 810 μl de fluide frais dans le compartiment inférieur des puits du module : ajoutez-la délicatement entre l’insert et la paroi du puits du module.
3. Fermez les couvercles et placez l’instrument dans l’incubateur. Connectez l’instrument à son ordinateur ; Allumez le contrôleur d’instrument et ouvrez le logiciel.
4. Sélectionnez « nouvelle mesure » dans la fenêtre contextuelle. Cochez les cases « show FEER » et « show Ccl » ; Après avoir terminé la première mesure, sélectionnez « Vérifier tous les puits » dans l'onglet « Résultats » pour voir toutes les valeurs TEER et de capacité de couche cellulaire (Ccl).
5. Enregistrez le fichier : Fichier>Enregistrer sous>' le nom de votre fichier'.
   REMARQUE : Comme TEER et Ccl sont mesurés en continu de manière automatisée, surveillez leurs valeurs sur une période de trois à cinq jours. Il n’est pas nécessaire de changer de milieu à moins que la viabilité cellulaire ne soit sous-optimale, comme le montre l’absence d’augmentation de TEER.
6. Choisissez le moment de co-cultiver des MBMEC avec des lymphocytes T lorsque Ccl est stable et inférieur à 1 μF/cm² et que TEER a atteint son niveau maximum.
7. Inspectez soigneusement les valeurs absolues TEER et Ccl et excluez les puits dans lesquels les MBMEC n’ont pas développé de monocouches suffisamment confluentes en décochant ces puits.
8. Regroupez le reste des puits : faites un clic droit sur un puits et sélectionnez « Ajouter un puits au nouveau puits moyen ». Nommez-le dans la fenêtre contextuelle ; Faites de même pour tous les puits individuels à regrouper.
9. Vérifiez tous les puits moyens pour confirmer qu’ils ont tous les mêmes conditions initiales avant la coculture. Si certains ont des valeurs absolues TEER ou des pentes TEER significativement différentes, ou si les erreurs-types sont trop importantes, refaites le regroupement.
   REMARQUE : Le regroupement optimal des puits permet une variation minimale des valeurs TEER au sein et entre les groupes expérimentaux.
10. Dans l'onglet « expérience », appuyez sur « pause », déconnectez l'instrument et sortez-le de l'incubateur. Retirez les couvercles sous le capot à flux laminaire.
11. Préparez des lymphocytes T préactivés et/ou naïfs, avec ou sans cytokines, anticorps ou autres substances spécifiques, selon le choix. Par exemple, mélanger un anticorps anti-interféron gamma (IFN-γ) de rat natif/à faible endotoxine (NA/LE) purifié (clone XGM1.2) avec des lymphocytes T préparés à 20 μg/ml par puits de l’instrument TEER.
    REMARQUE : Si des substances telles que l’inhibiteur de granzyme B sont utilisées, elles sont ajoutées à la culture de cellules T au début de la stimulation des cellules T : par exemple, l’inhibiteur de Granzyme B II (Calbiochem) est mélangé avec des cellules T isolées à une concentration finale de 10 μM dans du diméthylsulfoxyde (DMSO).
12. Retirez une partie du support de l’insert (compartiment supérieur du puits). Exemple : pipeter soigneusement 150 μl (il faut éviter d’enlever tout le milieu car cela pourrait perturber la monocouche MBMEC).
13. Ajoutez des lymphocytes T aux MBMEC en pipetant soigneusement 150 μl de milieu contenant 2 x 10⁵ cellules/insert.
    REMARQUE : Lors de la récolte de cellules T préactivées, ne comptez que les cellules sans Trypan Blue.
14. Fermez les couvercles et remettez l’instrument dans l’incubateur. Rebranchez l'instrument et appuyez sur « reprendre la mesure ». Après 24 heures, appuyez sur 'stop' dans l'onglet 'expérience' et enregistrez le fichier (Fichier>Enregistrer).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
cellZscope	nanoAnalytics GmbH	www.nanoanalytics.com	y compris : module de cellules à 24 puits, contrôleur, PC avec le logiciel cellZscope v2.2.2
Inserts de membrane Transwell - taille des pores 0,4 μm	Corning	Référence 3470	pour la mesure TEER comme lecture principale
Inserts de membrane Transwell - taille des pores 3 μm	Corning	Référence 3472	pour la mesure TEER en tant que contrôle de la qualité avant l’essai de transmigration des lymphocytes T
Plaque de culture cellulaire à 24 puits	Greiner	650 180	à fond plat ; pour la culture MBMEC
Plaque de culture cellulaire à 96 puits	Costar	Référence 3526	à fond rond ; pour la culture de cellules immunitaires
Chambre de comptage Neubauer	Marienfeld	Référence : MF-0640010	pour le comptage cellulaire
Collagène de type IV du placenta humain	sigma	Réf. C5533	pour la solution de revêtement MBMEC
Fibronectine du plasma bovin	sigma	F1141-5MG	pour la solution de revêtement MBMEC
DMEM (+ GlutaMAX)	Gibco	Référence 31966-021	pour l’isolement MBMEC et le milieu de culture MBMEC
Pénicilline/streptomycine	sigma	Réf. P4333	pour l’isolement MBMEC et le milieu de culture MBMEC
héparine	sigma	N° H3393	pour milieu de culture MBMEC
Facteur de croissance des fibroblastes de base humain (bFGF)	PeproTech	100 à 18 milliards	pour milieu de culture MBMEC
IMDM + 1 % L-Glutamine	Gibco	Référence 21980-032	pour milieu de culture de cellules T
IFN-γ murin recombinant	PeproTech	Référence 315-05	pour les tests de transmigration des lymphocytes T
TNF-α murin recombinant	PeproTech	Référence 315-01A	pour les tests de transmigration des lymphocytes T
Anticorps anti-IFN-γ purifié NA/LE	BD Biosciences	554408	clone XMG1.2 ; concentration finale recommandée : 20 μg/ml
Inhibiteur de Granzyme B II	Calbiochimie	368055	concentration finale recommandée : 10 μM
Anticorps CD4 anti-souris PE	Biolégende	116005	clone RM4-4 ; pour l’analyse de la transmigration des lymphocytes T
Trypan Blue solution, 0,4 %	Thermo Fisher Scientific	15250061	pour le comptage cellulaire