Coloration immunohistochimique des fibres nerveuses dans le noyau basal de Meyner du cerveau de souris

Résumé

Source : Singh, P., et al. Estimation stéréologique de la longueur des fibres cholinergiques dans le noyau basal de Meynert du cerveau de la souris. J. vis. exp. (2020)

Cette vidéo démontre la coloration immunohistochimique des fibres cholinergiques dans le noyau basal de la région de Meynert de coupes de cerveau de souris. Les sections sont bloquées et traitées avec de l’acétyltransférase primaire contre la choline, suivie d’anticorps secondaires biotinylés. Des complexes avidine-biotine-peroxydase sont ajoutés, qui se lient aux anticorps secondaires, puis au substrat chromogène. Les coupes sont ensuite déshydratées et montées avant d’être visualisées au microscope.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1. Perfusion et traitement tissulaire

1. Anesthésier les souris à l’aide d’une injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg). Pincez les orteils pour confirmer une absence de réponse avant de continuer.
2. Perfusion transcardique avec ~50 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) glacée de 0,1 M, suivie de 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans un tampon de phosphate (PB) de 0,1 M.
   ATTENTION : Le PFA est toxique. Utilisez un équipement de protection individuelle (EPI) lorsque vous travaillez avec du PFA.
3. Retirer les cerveaux et les immerger dans 4 % de PFA dans 0,1 M PB à 4 °C pendant 24 h pour la post-fixation. Laver avec DPBS 3x.
4. Passer à une solution de saccharose à 15 % dans 0,1 DPBS pendant la nuit, puis à une solution de saccharose à 30 % dans 0,1 M DPBS pendant 48 h supplémentaires à 4 °C.
5. Retirer le tissu de la solution de saccharose et le congeler dans une chambre de cryotome préréglée à une température de -20 °C. Les échantillons congelés peuvent être conservés dans des tubes scellés à -80 °C jusqu’à la section.
6. Encastrer les tissus dans le milieu d’enrobage à la température de coupe optimale (voir Tableau des matériaux) et monté sur un disque d’échantillon. Découper en série des coupes de 30 μm d’épaisseur dans un plan coronal à l’aide d’un cryotome et collecter toutes les sections en conséquence dans des plaques de culture à 24 puits remplies d’une solution cryoprotectrice (30 % de glycérol, 30 % d’éthylène glycol, 40 % de DPBS ; Figure 1A–C). Conserver au congélateur à -20 °C.
   REMARQUE : Des sections plus épaisses (par exemple, 50 μm) sont préférables lorsque cela est possible. Assurez-vous que les sections sont maintenues dans l’ordre de coupe et que toutes les sections sont complètement en cryoprotecteur. Une plaque de 96 puits peut être utilisée comme alternative aux plaques de 24 puits pour collecter des sections.
7. Couvrez les puits avec un scelleur à plaques pour éviter l’évaporation et le séchage. Conservez les plaques à -20 °C jusqu’à nouvel ordre. Les coupes conservées à -20 °C sont stables pendant plusieurs mois pour l’immunohistochimie de la choline acétyltransférase (ChAT).

2. Sélection systématique des sections pour IHC

REMARQUE : Une étude pilote doit être réalisée pour connaître le nombre total de sections nécessaires pour atteindre un coefficient d’erreur (CE) acceptable. La valeur CE est une expression de la quantité totale d’erreur dans la procédure d’échantillonnage. La valeur la plus basse représente l’erreur minimale, et une valeur CE inférieure à 0,1 est considérée comme acceptable par le logiciel utilisé ici (voir Table des matériaux).

1. Identifiez la première et la dernière section de chaque cerveau en comparant les caractéristiques morphologiques avec un atlas standard du cerveau de souris tel que Franklin et Paxinos. Le noyau basalis de Meynert ou NBM commence à -0,0 mm et se termine à -1,6 mm. Par conséquent, environ 50 sections contiennent du NBM. Le nombre total de sections est l’un des paramètres requis lors de la stéréologie. La sélection de chaque 8^e section (SSF = 1/8) a donné un total de 6 à 7 sections pour l’analyse et a donné un CE acceptable pour l’estimation du volume et l’estimation de la longueur des fibres dans notre étude pilote.
2. Commencez au hasard par l’une des huit premières sections, puis échantillonnez systématiquement toutes les 8^e section jusqu’à la dernière section postérieure contenant le NBM (Figure 1C).

3. Immunohistochimie

1. Transférez les sections cryoconservées à température ambiante dans un cryoprotecteur, puis un tampon phosphate (PB) 0,1M dans des plaques à 6 puits.
2. Laver 3x dans PB.
3. Incuber dans 0,3 % H₂O₂ dans du méthanol pendant 15 min.
4. Laver 3 fois dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS).
5. Incuber dans 0,25 % de Triton X-100 dans TBS pendant 30 min.
6. Bloc avec 10 % de sérum bovin normal (NBS) dans 0,1 % de Triton X-100 dans du TBS pendant 30 min.
7. Incuber avec une dilution de 1:1 000 d’anticorps primaires anti-ChAT de chèvre (voir Table des matériaux) dans le TBS avec 0,1 % de Triton X-100 et 1 % de NBS pendant 48 h à 4 °C.
8. Laver 3 fois dans TBS à température ambiante. Effectuez toutes les autres incubations et lavages à température ambiante.
9. Incuber avec un anticorps secondaire anti-chèvre bovin biotinylé (voir Table des matières) pendant 1 h.
10. Laver 3x dans TBS.
11. Incuber avec le complexe avidine-biotine-peroxydase (voir Table des matériaux).
12. Laver 3x dans TBS.
13. Développer à l'aide d'une solution de substrat de peroxydase DAB améliorée (voir Table des matériaux) selon les recommandations du fabricant.
    ATTENTION : Le DAB est suspecté d’être cancérigène. Il est toxique par contact et par inhalation. Utilisez des EPI lorsque vous travaillez avec DAB.
14. Lavez la section plusieurs fois avec de l’eau distillée et conservez-la dans Tris pH = 7,6.
15. Montez les sections sur les lames gélatinisées. Toutes les sections d’un même tissu peuvent être placées sur la même lame. Faites sécher les sections à l’air libre, déshydratez-les 2 fois pendant 5 minutes chacune avec 70 %, 90 %, 95 % et 100 % d’éthanol, puis nettoyez les sections avec deux lavages de xylène de 10 minutes. Recouvrement des sections à l’aide d’un support de montage (voir Tableau des matériaux).
    REMARQUE : Le temps de traitement de la déshydratation et du nettoyage affecte l’épaisseur des sections. Par conséquent, les mêmes conditions doivent être utilisées pour toutes les sections. Dans l’étude actuelle, la valeur moyenne de l’épaisseur finale était de 21,11 ± 0,45 μm.
16. Gardez les sections de la hotte à sécher. Les sections sèches sont prêtes pour la stéréologie.

Résultats

Figure 1 : Illustration du traitement et de l’échantillonnage des tissus utilisés dans la présente étude. Préparation et échantillonnage des échantillons. (A) Le cervelet et le bulbe olfactif sont retirés avant d’être montés sur le disque de l’échantillon. (B) Orientation du cerveau sur le disque de l’échantillon pour la coupe de section. Une incision longitudinale peu profonde (marquée d’une ligne) ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit ABC	Laboratoires Vector	Référence : PK6100
Anticorps anti-ChAT	Millipore, MA, États-Unis	AB144P
Anti-chèvre bovine IgG-B	Biotechnologie Santacruz	SC-2347
Sérum Bovin, Adulte	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	B9433
Cryostat	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, États-Unis
Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	D5652
Éthylène glycol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	324558
Glycérol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	G2025
Peroxyde d’hydrogène	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, États-Unis	N° H1009
Kit Immpact-DAB	Laboratoires Vector	SK4105	Solution de substrat de peroxydase DAB améliorée
Kétamine	Westward Pharmaceuticals, NJ, États-Unis	0143-9509-01
Microscope	Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, États-Unis	AF6000	Équipé d’une platine motorisée et d’une caméra numérique couleur IMI-tech
Température de coupe optimale (O.C.T.) milieu d’enrobage	Sciences de la microscopie électronique, Pennsylvanie, États-Unis	62550-12
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	P6148
Support de montage Permount	Sciences de la microscopie électronique, Pennsylvanie, États-Unis	17986-01
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	Réf. T8787
Base Trizma	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	Réf. T1503	Base Tris
Chlorhydrate de Trizma	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	Réf. T5941	Chlorhydrate de Tris
Xylazine	Bayer, Leverkusen, Allemagne	Rompun
Xylènes histologiques	Sigma-Aldrich, Saint-Louis, Missouri	534056