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1. Absorption de la dopamine synaptosomale
REMARQUE : Ce protocole est destiné à l’évaluation parallèle de deux cerveaux, mais il peut également être utilisé avec succès pour réaliser des expériences d’absorption synaptosomale de la dopamine (DA) avec quatre cerveaux en parallèle.
- Préparatifs
- Étiquette 48 microtubes à centrifuger de 1,5 mL par Tableau 1 (24 pour chaque cerveau). Utilisez des couleurs différentes pour les tubes appartenant à chaque cerveau afin d’éviter toute confusion entre les échantillons.
- Etiquette 51 tubes à scintillation #1-51.
- Placez une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sur de la glace. Cela sera utilisé pour garder les cerveaux au frais.
- Allumez la centrifugeuse pour lui permettre de pré-refroidir à 4 °C.
- Pré-pesez deux micro-tubes à centrifuger pour obtenir le poids exact des tissus lors de la préparation synaptosomale (section 2.6).
- Préparez le tampon d’homogénéisation en mélangeant 4 mM d’HEPES et 0,32 M de saccharose. Ajustez le pH à 7,4 et gardez sur de la glace.
REMARQUE : Le tampon d’homogénéisation peut être conservé dans des aliquotes à -20 °C et décongelé le jour de l’expérience.
- Préparez le tampon d’absorption en combinant les éléments suivants : 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1 mM d’acide ascorbique (0,194 g/L), 5 mM de D-glucose (0,991 g/L). Ajustez le pH à 7,4 avec du NaOH (conduit à une concentration de sodium d’environ 130 mM) et maintenez sur de la glace.
REMARQUE : Pour 2 cerveaux, préparez un tampon d’absorption de 1500 ml. Préparez le tampon d’absorption sous la forme d’une solution mère 10x sans acide ascorbique et le glucose maintenu à 4 °C. Préparez 1x solution de travail fraîche le jour même, en complétant avec de l’acide ascorbique et du glucose. Ajustez le pH avec du NaOH à 7,4.
- Préparez le tampon d’absorption + le ligand en combinant les éléments suivants : 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1 mM d’acide ascorbique (0,194 g/L), 5 mM de D-glucose (0,991 g/L), 1 μM de pargyline, 100 nM de désipramine, 10 nM d’inhibiteur de la catéchol-O-méthyl-transférase (COMT). Ajustez à pH 7,4 avec du NaOH et conservez sur de la glace.
REMARQUE : Utilisez un tampon d’absorption de 50 ml et ajoutez un ligand. La pargyline est ajoutée pour aider à prévenir la dégradation du DA par oxydation par la monoamine oxydase (MAO). Un inhibiteur de la COMT (RO-41-0960) est ajouté pour prévenir la dégradation des DA (catécholamines en général) par la COMT. La désipramine est ajoutée pour inhiber l’absorption par les transporteurs de noradrénaline et de sérotonine, et ainsi rendre les résultats d’absorption spécifiques pour le transporteur de dopamine (DAT).
- Préparez le tampon d’absorption + ligand + cocaïne (coc) en combinant les éléments suivants : 25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 1,2 mM MgSO4, 1 mM d’acide ascorbique (0,194 g/L), 5 mM de D-glucose (0,991 g/L), 1 μM de pargyline, 100 nM de désipramine, 10 nM d’inhibiteur de COMT, 500 μM de cocaïne. Ajustez le pH à 7,4 avec du NaOH et gardez sur de la glace.
REMARQUE : Utilisez un tampon d’absorption de 7 ml + ligand et ajoutez de la cocaïne. La cocaïne est ajoutée pour obtenir une mesure de fond de l’absorption non spécifique de DA à soustraire des données, ne laissant que l’absorption spécifique de DAT (puisque le SERT et la TNE sont inhibés par la désipramine, comme décrit ci-dessus). Alternativement, un inhibiteur de DAT très puissant et spécifique, GBR-12935, peut être utilisé à la place.
Important : Gardez tout sur la glace à partir de maintenant.
- Préparation synaptosomale
- Sacrifiez une souris à la fois par luxation cervicale et décapitation.
- Coupez la peau à l’aide de ciseaux pour révéler le crâne et coupez tout excès de tissu postérieur du crâne laissé par la décapitation. Coupez le crâne avec de petits ciseaux droits le long de la sutura sagittalis, en finissant aussi antérieurement que possible.
- Placez les deux pointes de ciseaux dans chaque œil de la souris et coupez le crâne pour retirer le reste du crâne et le cerveau intact. Retirez rapidement le cerveau et placez-le dans du PBS glacé. Cela le gardera froid pendant que le deuxième cerveau est disséqué.
- À l’aide d’une matrice cérébrale, disséquez une tranche coronale de 3 mm du striatum (antéro-postérieur : +1,5 mm à -1,5 mm), suivie d’une dissection plus fine à l’aide d’un perforateur. Voir Figure 1 pour la zone de poinçonnage.
- Gardez le tissu sur la glace en tout temps en avançant.
- Transférez le tissu dans un tube de micro-centrifugeuse de 1,5 mL pour la pesée.
REMARQUE : Ce poids sera utilisé à l’étape 1.2.14.
- Répétez les étapes 1.2.1 à 1.2.6 pour le deuxième cerveau.
- Une fois que le poids a été obtenu pour les deux cerveaux, transférez le tissu dans un verre d’homogénéisation contenant 1 mL de tampon d’homogénéisation glacé.
- Homogénéiser le tissu à l’aide d’un pilon motorisé à 800 tr/min, 10 coups réguliers.
REMARQUE : Un trait équivaut à une action de haut en bas. Le premier coup doit durer environ 5 s, les suivants 3-4 s. L’homogénéisation en milieu isotonique est importante pour éviter l’éclatement des synaptosomes. L’utilisation d’une force appropriée et d’un milieu isotonique permettra aux terminaisons présynaptiques de refermer le cytoplasme enveloppant, les vésicules synaptiques, les mitochondries et le cytosquelette.
- Transférez l’homogénat dans un microtube à centrifuger de 1,5 mL et récupérez l’homogénat restant du verre d’homogénéisation en le rinçant avec un tampon d’homogénéisation supplémentaire de 0,5 mL.
- Conservez l’échantillon sur de la glace pendant que les tissus de l’autre cerveau sont homogénéisés. Faites fonctionner les deux cerveaux en parallèle aux étapes 1.2.12-1.2.13.
- Granuler les noyaux et les débris cellulaires par centrifugation (1 000 x g, 10 min, 4 °C).
- Transvaser le surnageant (S1) (contenant les membranes cellulaires et le cytoplasme) dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifuger à 16 000 x g pendant 20 min à 4 °C.
- Jeter le surnageant (contenant le cytoplasme) et remettre en suspension la pastille (P2) (contenant des synaptosomes bruts) dans un tampon d’homogénéisation de 40 μL/mg de tissu (sur la base du poids obtenu à l’étape 1.2.6). Remettez doucement en suspension la fraction synaptosomale brute à l’aide d’une pipette p1000, car une force trop importante casserait les synaptomes.
REMARQUE : Il est important de finir avec au moins 280 μL. Sinon, une dilution à plus de 40 μL par mg sera nécessaire. Les étapes 1.2.1 à 1.2.13 doivent être exécutées le plus rapidement possible et tout doit être maintenu sur la glace. Dès que les synaptosomes bruts ont été remis en suspension dans un tampon d’homogénéisation, ils sont assez stables tant qu’ils sont maintenus sur de la glace.
2. Expérience d’absorption
- Ajouter 440 μL de tampon d’absorption + ligand + cocaïne dans les 12 tubes de microcentrifugation de 1,5 mL désignés et 440 μL de tampon d’absorption + ligand dans les 36 tubes de microcentrifugation de 1,5 mL restants (voir Tableau 1 pour la mise en page).
REMARQUE : Retirez-les de la glace 15 min avant le début de l’expérience pour les ramener à température ambiante, mais gardez-les sur la glace jusque-là pour conserver les inhibiteurs.
- Préparer la courbe de saturation (dopamine (2, 5, 6-[3H]-DA) (dopamine 3-H) (91,1 Ci/mmol) à diverses concentrations finales (0,031, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 et 1,0 μM)).
- Étiquetez six tubes de microcentrifugation de 2 ml comme 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 et 0,31.
- Ajoutez 750 μL de tampon d’absorption + ligand dans les 5 tubes de microcentrifugation avec le nombre le plus bas.
- Ajouter 1 455,4 μL de tampon d’absorption + ligand, 14,6 μL de dopamine (1 mM), 30 μl de dopamine 3-H (11 μM) dans le tube étiqueté 10.
- Transférez 750 μL du tube étiqueté 10 au tube étiqueté 5. Mélangez bien et transférez 750 μL de ce tube vers le tube 2,5. Répétez cette dilution avec les tubes restants.
- Pré-rincez les filtres en microfibre de verre avec un tampon d’absorption de 4 ml après les avoir placés sur un seau filtrant à 12 puits.
- Ajouter 10 μL de suspension de membrane synaptosomale aux 24 premiers tubes de micro-centrifugeuse de 1,5 mL (voir Tableau 1 pour la disposition) contenant 440 μL de tampon. Vortex avec précaution et tournez brièvement pour vous assurer que les synaptosomes sont immergés dans le tampon. Laisser à 37 oC pendant 10 min.
NOTE : Il est important d’être précis sur les moments pendant l’expérience d’absorption pour une comparaison équitable entre les cerveaux. Utilisez un chronomètre pour plus de précision.
- Ajouter 50 μL de dopamine aux concentrations 10 et 5 μM (section 2.2) dans les deux premières colonnes et laisser à 37 oC pendant 5 min en agitant. Après exactement 5 minutes, arrêtez la réaction en ajoutant 1 ml de tampon d’absorption glacé. Faites de même avec les concentrations 2,5 et 1,25 μM (section 2.2), puis avec les concentrations 0,62 et 0,31 μM.
- Ajoutez les échantillons dans les filtres en microfibre pré-rincés et lavez-les avec un tampon d’absorption glacé de 5 x 4 ml. Lorsque les 12 premiers échantillons ont été ajoutés aux filtres, déplacez les filtres dans des tubes à scintillation. Répétez cette opération avec les 12 échantillons suivants.
- Répétez les étapes 2.4 à 2.6 pour le cerveau suivant.
- Préparez 3 tubes à comptage maximal en plaçant un filtre en microfibre au fond des tubes à scintillation 49-51 et en ajoutant 25 μL de la concentration maximale de dopamine sur le dessus (10 μM).
- Laissez les 51 tubes à scintillation dans une hotte pendant 1 h.
- Ajoutez 3 ml de liquide à scintillation dans chaque tube à scintillation et agitez vigoureusement sur un agitateur pendant 1 h.
- Compter [3H]-DA dans un compteur bêta pendant 1 min.
- Ouvrez le programme et choisissez : Étiquette : H-3, Plaque/Filtre : Flacon de 4 mL, 4 par 6, Type de dosage : Normal et Temps de comptage : 1 min.
REMARQUE : Cette étape peut être effectuée le lendemain si cela est plus pratique. Laissez les échantillons recouverts de papier d’aluminium pendant la nuit.
- Détermination des protéines
- Utilisez une trousse standard de dosage des protéines BCA pour déterminer les concentrations en protéines des synaptosomes afin de les ajuster du nombre de calories par minute (cpm) à fmol/min/μg et pour comparer correctement l’absorption entre les échantillons.
3. Analyse des données
- Utilisez les données de l’expérience d’absorption pour créer une courbe de saturation pour chaque groupe et calculer la vitesse de la réaction (Vmax) et la constante de Michaelis Menten (KM).
REMARQUE : La valeur KM reflète la concentration de substrat nécessaire pour atteindre la moitié de Vmax. En conséquence, Vmax reflète directement la fonction de DAT (capacité d’absorption maximale), qui dépend du nombre de DAT à la surface et de la façon dont son activité peut être modulée par des modifications post-traductionnelles et/ou des protéines en interaction, ainsi que par des altérations des gradients ioniques. La valeur KM est une mesure indirecte de l’affinité du substrat pour le transporteur qui, surtout, peut également être modulée par des modifications post-traductionnelles et/ou des protéines en interaction. Pour évaluer pleinement les changements fonctionnels, il est donc important de déterminer directement les niveaux d’expression de surface, par exemple par un test de biotinylation de surface.
Tableau 1 : Disposition du tube de microcentrifugation pour la préparation synaptosomale.
| 10 | 5 | 2.5 | 1,25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2,5 | 1,25 | 0.62 | 0.31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0.62 | 0.31 |
| 10+coc | 5+coc | 2.5+COC | 1.25+COC | 0.62+coc | 0.31+coc |
