Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié
1. Détermination de la protéine de liaison au calcium ou de la teneur en protéines des interneurones et visualisation de la biocytine à la suite d’enregistrements électrophysiologiques et de remplissage de la biocytine
Remarque : À la fin des enregistrements électrophysiologiques, les coupes contenant des cellules remplies de biocytine sont fixées pendant la nuit avant les procédures histologiques. La solution fixatrice sera remplacée par un seul changement de tampon de phosphate de 0,1 M le lendemain matin si le reste de la procédure est effectué un autre jour afin d’éviter les lésions tissulaires. La solution de fixation (paraformaldéhyde à 4 %, solution d’acide picrique saturé à 0,2 %, solution de glutaraldéhyde à 0,025 % dans un tampon phosphate (PB) à 0,1 M) doit être fraîche le jour de l’enregistrement pour de meilleurs résultats.
- À la fin de l’enregistrement électrophysiologique, prélevez soigneusement la tranche contenant la ou les cellules enregistrées à l’aide d’un pinceau et placez-la dans un pot contenant du liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF).
note: Les détails du protocole utilisé pour la préparation de coupes et les enregistrements intracellulaires à l’aide d’électrodes tranchantes ont été décrits précédemment.
- Dans une hotte, ramassez soigneusement la tranche de cerveau avec un pinceau et roulez-la sur un petit morceau de papier filtre de qualité fine. Placez un autre morceau de papier filtre humidifié sur la tranche et placez les deux morceaux de papier filtre humide dans un petit pot en plastique contenant 5 à 10 ml de solution fixatrice et conservez-les au réfrigérateur pendant la nuit à 4 °C.
- Préparez une solution de gélatine dans de l’eau distillée. Placez 20 ml d’eau distillée dans un bécher sur une plaque chauffante et chauffez-la à 60 °C. Ajoutez progressivement 2,4 g de gélatine à l’eau, attendez qu’elle soit dissoute et laissez-la refroidir à 35-40 °C avant de l’utiliser pour éviter d’endommager les tissus.
- Remplacer la solution fixatrice par 2 mL de 0,1 M PB. Placez la tranche dans une boîte de Pétri et coupez tout excès de tissu avec une lame de scalpel. Placez le tissu coupé dans une boîte de Pétri (diamètre de 9 cm, hauteur de 1,4 cm), en veillant à ce qu’il repose à plat, sans plis ni plis, et retirez l’excédent de tampon à l’aide d’un pinceau sec.
- Couvrez le mouchoir avec la solution de gélatine chaude et placez la boîte de Pétri sur un bloc congelé pour refroidir rapidement la solution.
- À l’aide d’une lampe à angle équilibré pour fournir un contraste, regardez à travers le côté du plat et maintenez la tranche à plat en exerçant une légère pression d’un pinceau fin jusqu’à ce que la gélatine commence à prendre.
note: La gélatine peut être refondue si le tissu n’est pas plat. Toutes les imperfections à la surface de la gélatine causées par l’enlèvement du pinceau au fur et à mesure qu’il se solidifie peuvent être éliminées en faisant fondre doucement la couche superficielle en déplaçant l’ampoule de la lampe près de la surface pendant quelques secondes.
- Placez le plat de gélatine au réfrigérateur et laissez-le à 4 °C pendant 30 à 60 min.
- Dans une hotte, découpez un petit bloc (~ 1 x 1 cm) contenant le tissu incrusté de gélatine du plat à l’aide d’une lame de scalpel, soulevez le bloc à l’aide d’une petite spatule et placez-le soigneusement dans la même solution fixatrice fraîche que celle utilisée pour fixer les tranches pendant au moins 30 min à 4 °C.
- Lavez trois fois le bloc de gélatine dans 5 mL de 0,1 M PB, séchez-le à l’aide d’un mouchoir en papier et collez le bloc vers le haut (c’est-à-dire avec le mouchoir en haut) sur un mandrin de vibratome à l’aide de super colle.
- Enlevez l’excès de colle avec un morceau de papier filtre et utilisez une lame de scalpel pour couper les coins du bloc, en laissant une forme de diamant.
- Sectionnez la tranche à 50 μm d’épaisseur à l’aide d’un vibratome et placez soigneusement chaque section dans un flacon en verre contenant 10 % de saccharose.
- Prélevez délicatement une section du flacon et placez-la à plat dans un couvercle de boîte de Pétri. À l’aide d’un microscope à dissection et d’une lame de scalpel fraîche, retirer la gélatine du pourtour de la section et la remettre dans un flacon contenant 2 ml de saccharose frais à 10 % /<>
note: Il est crucial d’éliminer autant de gélatine que possible à ce stade pour réduire le rétrécissement des tissus lors de l’étape de déshydratation (étape 1.37).
- Cryoprotégez les sections dans une solution de saccharose-glycérol à base de 0,1 M de PB à température ambiante en les incubant pendant 10 min dans une solution de saccharose à 10 %, 20 min dans une solution de saccharose à 20 % et de glycérol à 6 % deux fois et enfin 30 min dans une solution de saccharose à 12 % de glycérol à 12 % deux fois sous agitation constante.
- Placez les sections à plat sur un petit rectangle de papier d’aluminium à l’aide d’un pinceau. Retirez tout excès de liquide des sections et pliez soigneusement le papier d’aluminium en un paquet.
- Tenez le colis près de la surface de l’azote liquide sans toucher la surface pendant 30 s, puis laissez les sections dégeler complètement pendant environ 30 s. Répétez la congélation-décongélation deux fois de plus.
- Retirez toutes les sections à l’aide d’un pinceau et placez-les dans un flacon en verre contenant 2 ml de PB 0,1 M sous une agitation constante pour éliminer l’excès de saccharose.
- Retirer le PB à l’aide d’une pipette Pasteur et incuber les sections dans 2 mL de peroxyde d’hydrogène aqueux à 1 % (H2O2) pendant 30 min. Laver les sections dans 2 mL de PB 0,1 M 3 x 5 min.
- Prélever le PB 0,1 M à l’aide d’une pipette Pasteur et ajouter du borohydrure de sodium à 1 % (NaBH4) dans du PB.
note: Ne bouchez pas le flacon, car la solution NaBH4 dégage de l’hydrogène gazeux.
- Retirer le borohydrure de sodium à l’aide d’une pipette Pasteur et laver soigneusement les sections dans 2 mL de 0,1 M PB 5x 5 min.
- Remplacer le PB de 0,1 M par 10 % de sérum de chèvre normal (NGS) dans le PB de 0,1 M pendant 30 min.
- Retirez le sérum de chèvre et incubez les sections pendant une nuit à 4 °C dans un mélange d’anticorps monoclonaux de souris et de lapin composé d’une solution ABC.
note: Le tableau 1 présente une liste des anticorps primaires utilisés dans des études antérieures.
- Incuber les sections pendant 2 h dans l’obscurité dans un mélange d’anticorps secondaires marqués par fluorescence (Table des matières).
- Montez les sections sur les glissières dans le support de montage et couvrez-les avec une lamelle.
- Prenez des images du marquage par fluorescence à un grossissement de 40X (Figure 1Bb).
- Après l’imagerie par fluorescence, placez la lame dans une boîte de Pétri en verre contenant du PBS et retirez soigneusement la lamelle. Ensuite, lavez les sections de la lame à l’aide de douces impulsions de PBS à l’aide d’une pipette Pasteur. Placez les sections dans un flacon en verre propre contenant du PBS.
- Effectuez la réaction avidine-HRP en incubant d’abord les sections dans ABC pendant au moins 2 h pour amplifier le produit de réaction HRP.
- Préparez la solution de 3,5-diaminobenzidine (DAB) en ajoutant un comprimé à 5 mL d’eau distillée.
- Lavez les sections avec du PBS trois fois pendant 10 min, puis avec le tampon Tris deux fois pendant 10 min. Retirez le tampon Tris après le dernier lavage.
- Ajoutez rapidement une goutte de solution de NiCl2 (chlorure de nickel) à 8 % à la solution DAB, pipetez la solution pour la mélanger et ajoutez-la rapidement à 1 mL de cette solution sur les sections. Incuber les sections dans la solution DAB/NiCl2 pendant 15 min.
- Ajouter 10 μL de 1 % H2O2 à la solution DAB. Laissez la réaction se dérouler dans l’obscurité sous une agitation constante pendant environ 1 à 2 minutes, et surveillez le marquage des cellules remplies avec un microscope à dissection.
- Arrêtez la réaction en retirant la solution DAB/NiCl2/H2O2 et lavez les sections avec un tampon Tris deux fois pendant 5 min.
- Dans une hotte, placez un petit cercle de papier filtre dans une boîte de Pétri et humidifiez-la avec 0,1 M PB. Soulevez les sections une par une de la fiole en verre à l’aide d’un pinceau et placez-les soigneusement à plat sur le papier.
- Couvrez les sections avec un autre cercle de papier filtre humidifié et retirez l’excès de tampon en touchant doucement le papier de soie à la surface.
- Appliquez 8 à 9 gouttes de tétroxyde d’osmium à 1 % dans 0,1 M PB sur le papier supérieur, couvrez le plat et conservez-le dans la hotte pendant au moins 30 min, mais pas plus de 1 h.
- Ouvrez la boîte de Pétri et soulevez le papier filtre supérieur. Soulevez soigneusement les sections une à la fois avec un pinceau, placez-les dans un flacon en verre et rincez-les deux fois à l’eau distillée.
- Éliminer les déchets de tétroxyde d’osmium de manière appropriée. Rincez tout le matériel jetable et placez-le dans les bacs appropriés.
- Placez chaque section à plat sur une lame de verre et glissez les sections. Transférez la lame dans une boîte de Pétri, placez un flacon en verre vide sur la lamelle pour la maintenir en place et couvrez d’alcool à 50 %. Après 15 min, retirez la lame de la solution et retirez les sections de la lame. Replacez les sections sur la lame, puis placez la lame dans de l’alcool à 70 % pendant 15 min. Répétez le même processus avec une solution à 95 % et enfin à 100 % d’alcool.
- Après l’étape de déshydratation, transférez les sections dans un flacon en verre contenant 100 % d’alcool sur un shaker dans une hotte. Remplacer la solution alcoolisée par de l’oxyde de propylène (C3H6O) et laver trois fois pendant 5 min. Après le dernier lavage, conservez ~2 ml d’oxyde de propylène dans le flacon et ajoutez de la résine (rapport 1:1). Assurez-vous que la résine est dissoute et maintenez les sections sous agitation constante pendant 30 min.
- Placez chaque section dans une planchette en aluminium contenant de la résine époxy à l’aide d’un bâtonnet en bois et incubez pendant la nuit.
REMARQUE : Ne laissez pas les sections dans la résine plus de 24 h pour éviter le risque d’endommager les sections.
- Placez la planchette sur une plaque chauffante pendant environ 10 min. Prenez chaque section avec un bâton en bois et placez-les sur une lame propre. Gardez l’orientation de chaque section cohérente à l’aide d’un microscope à dissection. Placez une lamelle sur les sections. Placez la lame au four pendant 48 h à 56 °C pour le durcissement.
Table 1 : Table des solutions.
| Solutions utilisées | Composition/Instructions |
| Solution de fixation | 4 % de paraformaldéhyde, 0,2 % de solution saturée d’acide picrique, 0,025 % de solution de glutaraldéhyde dans un tampon phosphate 0,1 M (PB) |
| Tampon phosphate 0,1 M pH 7,6 | Ajouter 100 ml de tampon phosphate 1 M à 900 ml d’eau distillée |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 7,4/7,5 | Ajouter 10 ml de tampon phosphate 0,1M, 0,2 g de KCl et 8,76 g de NaCl à 990 ml d’eau distillée |
| Tampon TRIS pH 7,5 | Dissoudre 5,72 g de chlorhydrate de Tris et 1,66 g de base de Tris dans 50 ml d’eau distillée. Préparez ensuite jusqu’à 1 L avec de l’eau distillée. |
| Solution fixatrice tamponnée de glutaraldéhyde et de paraformaldéhyde | Paraformaldéhyde à 4 %, solution d’acide picrique saturé à 0,2 %, solution de glutaraldéhyde à 0,025 % dans un tampon phosphate à 0,1 M. |
| La solution ABC | Solution à préparer au moins 30 min avant utilisation à partir du kit ABC. Ajouter 1 goutte de la solution A et 1 goutte de la solution B à 2,5 mL de PBS. |
| Résine époxy Durcupan : | Pour faire 20 pots : 20 g du composant A, 20 g du composant B, 0,6 g du composant C et 0,4 g du composant D- |
| Protégez la balance des déversements en recouvrant la plaque d’un cercle de papier filtre. Pesez soigneusement les réactifs dans un bécher tripour dans les proportions indiquées ci-dessus. Bien mélanger en remuant vigoureusement à l’aide de deux bâtonnets en bois pendant au moins 5 min. Le mélange doit devenir d’une densité uniforme de couleur brun foncé. Placez le bécher dans le four à ~50 °C pendant 10 min maximum pour éliminer autant de bulles d’air que possible. note: La résine commencera à durcir si vous laissez le bécher dans le four plus de 10 min. Décantez la résine dans des pots en plastique ou des seringues de 5 ml, datez-les et conservez-les dans le congélateur à -20 °C prêts à l’emploi. |
