Évaluation de la déficience motrice dans les modèles de C. elegans à l’aide du test de locomotion radiale

Résumé

Source : Currey, H. N., et al. Évaluation de la déficience motrice dans C. elegans Models of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo montre l’utilisation d’un test de locomotion radiale pour évaluer le dysfonctionnement moteur chez C. elegans exprimant la protéine TDP-43 humaine de type sauvage ou mutante de la SLA. Les vers avec des niveaux variables d’expression de TDP-43 de type sauvage ou mutant sont autorisés à ramper, et leur mouvement est mesuré par la distance radiale parcourue à partir du point central sur la plaque de test. Le test distingue les déficiences motrices légères, modérées et sévères en fonction de la distance parcourue par les différentes souches C. elegans.

Protocole

1. Essai de locomotion radiale

1. Préparez des boîtes de Pétri de 100 mm ou 150 mm de diamètre, à moitié remplies de milieux de croissance des nématodes (NGM) et ensemencées d’une pelouse uniforme de bactéries OP50 pour couvrir toute la surface de la gélose.
2. Retournez les plaques d’analyse NGM et étiquetez le fond avec un identificateur pour les souches de C. elegans à analyser, soit 2 plaques par souche (figure 1A).
3. Faites un petit point avec le marqueur au centre de la plaque renversée (Figure 1A).
4. Lorsque vous travaillez avec un microscope à dissection, transférez 15 à 20 vers appariés étagés au centre de la plaque de dosage directement au-dessus du point central (visible à travers le NGM) à l’aide d’un pic à fil de platine (Figure 1B).
   note: Essayez de transférer tous les vers en même temps ou le plus rapidement possible.
   1. Réglez une minuterie sur 30 min après que les vers sont placés au centre de la plaque. Remettez le couvercle sur l’assiette et mettez-le de côté (Figure 1C).
5. Continuez à transférer les vers jusqu’à ce que toutes les souches soient sur les plaques de dosage désignées, en notant le temps approximatif de transfert entre les plaques (visez ~ 1 min entre les plaques). Gardez toutes les plaques dans le même ordre qu’elles ont été installées.
6. Après 30 min, commencez à marquer la première plaque.
   1. Retirez le couvercle et placez la plaque face vers le bas sous le microscope de dissection, de sorte que le dos de la plaque soit orienté vers le haut et que la gélose NGM se trouve entre la ligne de visée et les vers. La plaque sera à l’envers lors d’une utilisation normale.
   2. Ajustez la mise au point du microscope jusqu’à ce que les vers soient visibles à travers la gélose.
   3. À l’aide d’un stylo-feutre de couleur différente du point central, placez un petit point à l’emplacement de chaque ver - suivez les traces du ver à travers la pelouse bactérienne pour trouver les animaux les plus distales.
   4. Vérifiez le bord de la plaque car des vers peuvent s’y retrouver. Comptez et notez également le nombre de vers dans le point central (Figure 1D).
7. Continuez à marquer toutes les plaques de dosage dans l’ordre, de sorte que toutes les plaques aient 30 minutes de temps d’activité, en prenant soin de tenir compte du temps nécessaire à la mise en place de la plaque. Ensuite, effectuez des mesures manuelles ou numériques comme décrit aux étapes 1.8 ou 1.9.
8. Effectuez des mesures manuelles à l’aide d’une règle.
   1. À l’aide d’une règle, mesurez en mm la distance entre le point central et les marques d’emplacement finales pour chaque ver et notez la distance. Pour aider à suivre la progression pendant le pointage, étiquetez le premier point marqué avec une petite ligne de marquage.
   2. Enregistrez les données de longueur de chaque point consécutivement en tournant la plaque dans le sens des aiguilles d’une montre (Figure 1E).
9. Effectuez des mesures numériques à l’aide d’un scanner et d’ImageJ.
   1. À l’aide d’un scanner à plat, numérisez le dos de la ou des plaques d’essai à côté d’une règle (chiffres faisant face à la surface de numérisation) (Figure 2A).
   2. Ouvrez l’image de la plaque numérisée dans ImageJ ou un programme similaire.
      note: ImageJ est un logiciel gratuit de traitement d’images basé sur Java hébergé par le NIH.
   3. Cliquez sur l’outil Ligne droite, puis tracez une ligne reliant les points de 1 cm et de 2 cm sur l’image numérisée de la règle (Figure 2B).
      note: Maintenez la touche Shift de l’ordinateur pour forcer la ligne à l’angle de 45° le plus proche.
   4. Accédez au menu Analyser et utilisez-le pour définir l’échelle (Analyser | Régler l’échelle) (Figure 2C).
   5. Entrez la distance connue (10) et les unités de longueur (mm) dans les cases appropriées, n’ajustez pas la distance en nombre de pixels. Cochez la case Global pour appliquer la même échelle à toutes les images analysées dans chaque session ImageJ ; sinon, réglez l’échelle de chaque image lors de l’ouverture (Figure 2D). Cliquez sur Ok.
      note: Les étapes 1.9.2 à 1.9.5 sont effectuées pour régler l’échelle de mesure. Les mesures de cette image relieront désormais automatiquement la longueur des lignes à la relation pixel/longueur définie. Les images numérisées à 300 ppp auront un rapport approximatif de 11,8 pixels par mm.
   6. Utilisez l’outil Pinceau pour marquer juste au-dessus du premier point à marquer.
      note: Il s’agit d’un indicateur visuel pour le premier ver marqué.
   7. Utilisez l’outil Ligne droite pour tracer une ligne entre le point central et le premier point de données du ver.
   8. Cliquez sur la touche M du clavier pour mesurer la distance. Vous pouvez également accéder au menu Analyser et choisir Mesurer (Analyser | mesurer). Dans les deux cas, la mesure apparaîtra dans une nouvelle fenêtre ; Cette fenêtre collectera toutes les mesures par image.
   9. En gardant le point central constant, déplacez l’extrémité de la ligne touchant le premier point de vis sans fin vers le point de vis sans fin suivant, dans le sens des aiguilles d’une montre, et cliquez sur la touche M pour mesurer.
   10. Continuez à mesurer chaque point dans le sens des aiguilles d’une montre jusqu’à ce que tous les points soient marqués.
   11. Copiez et collez les données de mesure de longueur dans une feuille de calcul pour les enregistrer. Ensuite, répétez le processus pour chaque image de plaque numérisée.
       note: Les étapes 1.9.6 à 1.9.11 permettent de mesurer les valeurs de déplacement de la vis sans fin (Figure 2E-F).
10. Effectuer des analyses statistiques.
    1. Combinez les répétitions au sein d’une seule expérience de sorte que le nombre total de vers marqués se situe entre 30 et 40 vers.
    2. Effectuez des répétitions expérimentales indépendantes à des jours différents et avec des populations indépendantes de vers pour obtenir 3 répétitions expérimentales indépendantes.
    3. Analysez les données à l'aide d'analyses statistiques appropriées telles que le test t de Student pour 2 souches ou l'ANOVA à 1 facteur pour trois souches ou plus.

Résultats

Figure 1 : Flux de travail du test de locomotion radiale. Les panneaux A-E montrent les étapes généralisées du test de locomotion radiale. Les étapes sont les suivantes : (A) Les plaques NGM, avec OP50 ensemencé sur les bords, sont préparées en étiquetant et en marquant le point central, (B) les vers sont placés au centre de la gélose comme marqué p...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
C. elegans	Centre de Génétique de Caenorhabditis (CGC)	-	Acquérez vos souches comme vous le souhaitez, N2 est une souche de contrôle utile
Pipettes pasteur jetables, verre borosilicate	VWR	14673-010	Pipette en verre utilisée pour créer un pic à vis sans fin - tenez la pipette en verre dans une main et ~1" de fil de platine (tenu par une pince) dans l’autre au-dessus d’une flamme pour joindre.
Boîtes de Pétri jetables, 35x10mm	VWR	10799-192	Plaques de dosage pour le système d’imagerie WormLab
Boîtes de Pétri jetables, 60x15mm	VWR	25384-090	Plaques de crosse pour vers
Boîtes de Pétri jetables, 100x15mm	VWR	25384-302	Plaque d’essai de locomotion radiale standard
Boîtes de Pétri jetables, 150x15mm	VWR	25384-326	Plaque d’essai de locomotion radiale à plus longue période
Microscope de dissection	Leica	M80	Possibilités de maintenance des vers et de mise en place de tests de locomotion radiale
Marqueurs à pointe fine	VWR	52877-810	Besoin d’au moins 2 couleurs pour les tests de locomotion radiale. Pointes fines requises pour la précision.
Scanner à plat	Amazone	Epson Perfection V850	En option pour le test de locomotion radiale. Le protocole suppose une résolution de 300 dpi, la plupart des scanners fonctionneraient correctement
NGM (milieu de croissance des nématodes)	VWR	76347-412	Milieu utilisé pour cultiver C. elegans. Peut être créé à partir de zéro, voir WormBook : Maintenance of C. elegans
Bactérie OP50	Centre de Génétique de Caenorhabditis (CGC)	OP50	Principale source de nourriture pour C. elegans
P1000 pipeteur	VWR	76207-552	Pipettor, utilisé dans le test de nage
P1000 conseils	VWR	83007-384	Pointes pour pipeteur, utilisées dans le test de nage
Fil de platine, 0,2032mm de diamètre	VWR	BT136585-5M	Fil de platine de calibre fin utilisé pour créer un pic à vis sans fin - tenez une pipette en verre dans une main et ~1" de fil de platine (tenu par une pince) dans l’autre au-dessus d’une flamme pour joindre.
Règle	VWR	56510-001	Besoin de noter les tests de locomotion radiale
ImageJ	NIH	-	Logiciel libre optionnel fourni par le NIH - https://imagej.nih.gov/ij/
Système d’imagerie WormLab	MBF Bioscience	WormLab	Le système d’imagerie comprend Matériel WormLab (champ clair scène, caméra et logement) et le logiciel WormLab. https:// www.mbfbioscience.com/wormlabimaging- Système