Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Préparation
- Préparation et sectionnement des tissus
- Répartissez les rats au hasard en trois groupes : frais/salin (SAL ; 0,9 % de NaCl), préfixé/SAL et préfixé/3,4-méthylènedioxyméthamphétamine (MDMA ; voir détails dans tableau 1).
- Administrer trois doses de 1 ml/kg de SAL et de 10 mg/kg de MDMA par voie intrapéritonéale, respectivement, aux groupes SAL et MDMA à 2 heures d’intervalle. Laissez les animaux survivre au traitement pendant 6 jours.
- Le jour 7, administrer 100 mg/kg de kétamine en association avec 5 mg/kg de xylazine par voie intrapéritonéale aux rats pour une anesthésie profonde (c’est-à-dire , perte de clignement cornéen et réflexes de pincement de la queue).
- Pour le groupe frais/SAL, décapitez rapidement les rats et retirez le cerveau pour le test du cerveau frais.
- Pour les groupes préfixés/SAL et préfixés/MDMA, faites une incision le long du sternum d’environ 10 à 12 cm, puis exposez l’extrémité du sternum.
- Tenez l’extrémité du sternum avec un hémostatique et coupez le diaphragme latéralement des deux côtés avec des ciseaux tranchants, puis coupez vers le haut à travers les côtes et parallèlement aux poumons.
- D’une main, tenez l’extrémité ventrale du cœur à l’aide de petites pinces. De l’autre main, percez le ventricule gauche avec une aiguille de seringue de 18 G (notez que le côté adaptateur de l’aiguille est relié par un tuyau en silicone en forme de Y à des récipients de SAL et de paraformaldéhyde glacés et à des pompes péristaltiques).
- Allumez la pompe SAL au niveau moyen du débit (~5 ml/min) et percez l’oreillette droite avec la pince pour permettre l’échappement de la circulation de retour. Maintenir la perfusion de SAL pendant 30 min.
- Allumez la pompe de paraformaldéhyde à un niveau moyen et laissez le paraformaldéhyde glacé à 4 % pénétrer l’animal pendant 30 min.
- Retirez l’instrument de perfusion et décapitez l’animal. Faites une coupe postéro-antérieure à travers la ligne médiane du crâne, puis battez le crâne pour exposer la cavité du crâne.
- Retirez le cerveau de la cavité crânienne à l’aide d’une spatule et placez-le dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant 25 ml de paraformaldéhyde à 4 %. Conservez le cerveau à l’intérieur du tube contenant du paraformaldéhyde à 4 ºC au réfrigérateur pendant 24 heures.
- Placez le cerveau dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant 25 ml de solution de saccharose à 30 % à 4 ºC pendant 3 jours. Enfin, conservez le cerveau dans des sacs en plastique à -80 °C jusqu’à utilisation.
- Montez le cerveau sur un mandrin avec un support d’enrobage et congelez le support d’enrobage contenant le cerveau dans un cryostat à une température de -26 ºC. Coupez le cerveau fraîchement congelé en sections de 20 μm et le cerveau préfixé au paraformaldéhyde en sections de 10 μm. Transférez la coupe sur une lame de microscope à température ambiante (RT) en touchant la lame à la section.
- Séchage à l’air libre à RT pendant 4 heures. Conservez les lames de section dans un sac hermétique à -80 °C jusqu’à utilisation.
- Déshydratation
- Prenez des lames du congélateur à -80 °C et répartissez-les dans l’un des trois tests suivants : gène du récepteur de la sérotonine 5-HT2A (ht2a), ppiB (gène de la peptidylprolyl isomérase B, contrôle positif) ou dapB (gène de la dihydrodipicolinate réductase bactérienne, contrôle négatif) ; Marquez et étiquetez des sections avec un stylo à bille (n’utilisez pas de crayon). Diapositives immergées dans 100 % d’alcool à RT pendant 5 min. Faites sécher les lames pendant 5 min dans une hotte.
- Prétraitement
- Pipette de 20 μl du réactif de prétraitement-1 (inactivation de la phosphatase alcaline) sur les sections des lames. Placez les lames sur un rail de rack dans un bac à humidité (notez que le plateau est recouvert d’un couvercle pour maintenir une humidité élevée afin d’éviter l’évaporation de la solution réactionnelle).
- Secouez doucement le plateau d’humidité sur un shaker horizontal à basse vitesse pendant 10 min. Lavez les lames deux fois avec de l’eau doublement distillée (ddH2O) pendant 2 min. Immerger la lame dans un bécher de 200 ml contenant 150 ml du réactif de prétraitement-2 (rupture des réticulations induite par la fixation du paraformaldéhyde). Faire bouillir les lames pendant un total de 5 min à 100 ºC (restauration de la structure de l’ARN induite par la chaleur).
- Lavez les lames deux fois avec du jjH2O pendant 2 min. Placez les lames dans de l’alcool à 100 % pendant 5 min. Faites sécher les lames pendant 5 min dans la hotte. Utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner un cercle autour de la zone sélectionnée dans la section tissulaire (, par exemple , structures non corticales, y compris le thalamus et l’hypothalamus comme indiqué dans Figure 1).
- Pipetez 10 μl du réactif de prétraitement-3 (augmentation de la pénétration de la sonde) dans chaque zone sélectionnée et couvrez le bac à humidité avec le couvercle. Placez la plaque dans le four d’hybridation équipé du shaker horizontal et réglez la température du four à 40 ºC ; Agitez doucement le plateau pendant 30 min. Lavez les lames deux fois avec ddH2O pendant 2 min.
2. Hybridation et amplification
- Pipette 10 μl de réactifs de sonde htr2a, ppiB et dapB, respectivement, sur les zones sélectionnées. Couvrez le bac à humidité avec le couvercle pour éviter l’évaporation du réactif. Secouez doucement sur le shaker horizontal réglé à basse vitesse. Incuber les lames à 40 ºC au four pendant 2 h.
- Lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 min. Pipetez 10 μl du réactif d’amplification-1 sur chaque zone sélectionnée, agitez et incubez les lames à 40 ºC pendant 30 min.
- Lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 min. Pipeter 10 μl du réactif Amplification-2 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à 40 ºC pendant 15 min.
- Lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 min. Pipetez 10 μl du réactif Amplification-3 sur chaque zone sélectionnée, agitez et incubez les lames à 40 ºC pendant 30 min.
- Lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 min. Pipetez 10 μl du réactif Amplification-4 sur chaque zone sélectionnée, agitez et incubez les lames à 40 ºC pendant 15 min.
- Lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 min. Pipetez 10 μl du réactif Amplification-5 sur chaque zone sélectionnée, agitez et incubez les lames à RT pendant 30 min.
- Lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 min. Pipeter 10 μl du réactif Amplification-6 sur chaque zone sélectionnée, agiter et incuber les lames à RT pendant 15 min. Lavez les lames deux fois avec un tampon de lavage pendant 2 min.
3. Détection de signaux
- Pipetez 10 μl de réactif Red dans chaque zone sélectionnée (notez que le réactif est un mélange de Red-B et de Red-A dans un rapport de 1:60 et doit être utilisé immédiatement). Placez la lame dans le bac à humidité sur le shaker horizontal à RT et secouez doucement à basse vitesse pendant 10 min.
- Lavez les lames deux fois avec (ddH2O) pendant 10 min. Faites sécher les lames à 60 ºC au four pendant 15 min. Placez les lames dans du xylène sous la hotte pendant 5 min. Pipeter 20 μl de support de montage à base de xylène sur chaque zone sélectionnée et couvrir avec une lamelle.