Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Trancher le cerveau
- Orientez l’échantillon de manière à ce que la face dorsale du cervelet soit sur la face avant. Versez de la découpe glacée ACSF (liquide céphalo-rachidien artificiel), contenant 1 μM TTX (tétrodotoxine), suffisante pour immerger complètement le cervelet. Placez un tube de gaz dans l’ACSF et commencez à bouillonner avec le mélange gazeux O2/CO2.
- Retirez la matière arachnoïdienne à l’aide d’une pince à épiler fine sous des jumelles. Coupez le pédoncule cérébelleux à l’aide d’une lame et retirez le tronc cérébral et le bloc de gélose. Faites pivoter le plateau de 180°, de sorte que la surface dorsale du cervelet fasse face à une lame de rasoir.
- Réglez la lame et ajustez le premier emplacement de coupe. Réglez les paramètres de tranchage du vibratome sur les suivants : amplitude à 5,5, fréquence à 85 Hz, vitesse à 3-4 et épaisseur de la tranche à 300 μm.
- Transférez la tranche cérébelleuse sur un filet de nylon dans un incubateur en acrylique et immergez-la complètement dans l’ACSF oxygéné. L’incubateur doit être placé dans un bain-marie qui maintient une température de 26 °C.
- Conservez les tranches pendant au moins 1 h pour permettre de récupérer des dommages lors du tranchage.
2. Enregistrement par patch-clamp à cellules entières
REMARQUE : Un enregistrement par patch-clamp nécessite l’équipement suivant : un microscope droit avec optique à contraste interférentiel différentiel infrarouge (IR-DIC), un amplificateur à patch-clamp, un numériseur de données, un stimulateur numérique, un isolateur, un ordinateur, un logiciel pour l’acquisition et l’analyse de données, un manipulateur motorisé, une plate-forme de microscope, une table d’isolation des vibrations, une cage de Faraday, un système de chauffage de solution, des pompes péristaltiques et un extracteur d’électrodes.
- Ajoutez de la picrotoxine (0,1 mM) à l’ACSF et faites-la dissoudre par ultrasonication pendant 3 min.
- Perfusion d’une chambre d’enregistrement avec de l’ACSF saturé d’O2-CO2 contenant des picrotoxines à raison de 2 mL/min. Maintenez la température de la chambre d’enregistrement à environ 30 °C.
- Réalisez une électrode d’enregistrement en tirant un capillaire en verre borosilicaté avec filament (diamètre extérieur = 1,5 mm) à l’aide d’un extracteur à 4 étapes. Le diamètre de la pointe doit être d’environ 1 μm.
- Fabriquez une électrode stimulante en tirant sur le même capillaire à l’aide de l’extracteur en 2 étapes, puis cassez pour produire une pointe fine en frappant la pointe contre un bloc de fer sous un microscope binoculaire. Le diamètre final doit être de 3 à 5 μm.
- Transférez la tranche cérébelleuse dans la chambre d’enregistrement et fixez-la avec un poids Pt avec des fils de nylon. Remplissez une électrode stimulante avec de l’ACSF.
- Pour stimuler les PF, placez l’électrode de stimulation à la surface de la couche moléculaire, à environ 50 μm de la couche cellulaire de Purkinje.
- Pour stimuler la FC, placez l’électrode de stimulation au bas de la couche de cellules de Purkinje (étapes 3.3, 3.4).
- Filtre à base de K+ ou Cs+ avec un filtre de 0,45 μm. À l’aide d’un microchargeur, remplissez une électrode d’enregistrement avec 8 μL de solution interne.
- Appliquez une faible pression positive sur l’électrode d’enregistrement avant de l’immerger dans l’ACSF. Sa résistance doit être de 2 à 4 MΩ et le potentiel de jonction du liquide doit être corrigé.
- Approchez-vous du corps cellulaire sain et brillant du PC avec l’électrode d’enregistrement. Poussez légèrement la surface de la cellule de Purkinje, arrêtez d’appliquer une pression positive, puis appliquez une pression négative jusqu’à ce qu’elle forme un joint giga-ohm. Établissez ensuite la configuration de l’ensemble de la cellule à l’aide d’une pression négative.
- Maintenez le potentiel de membrane à -70 mV et appliquez une impulsion de -2 mV (durée, 100 ms) à 0,1 Hz pour surveiller la résistance d’entrée, la résistance série et la capacité d’entrée, en continu. N’utilisez pas la compensation de résistance en série. Supprimez les données lorsque la résistance série varie de plus de 15 %.
3. Induction de la LTD (dépression à long terme)
- Stimuler la couche moléculaire avec une impulsion (durée, 0,1 ms). Identifiez les courants postsynaptiques excitateurs PF(Parallel fibers) en appliquant un stimulus à double impulsion (intervalle entre pointes (ISI) de 50 ms). Le PF-EPSC doit présenter une facilitation par impulsions appariées et une augmentation progressive de l’amplitude par rapport à l’augmentation de l’intensité de la stimulation.
- Enregistrez la réponse d’essai du PF-EPSC en appliquant une seule impulsion à 0,1 Hz. Ajustez l’intensité du stimulus de sorte que l’amplitude évoquée de l’EPSC soit d’environ 200 pA. Évitez la contamination du courant par le canal ionique dépendant de la tension.
- Stimulez la FC au bas de la couche de cellules de Purkinje et identifiez l’EPSC provoquée par l’activation de la FC (en appliquant un stimulus à double impulsion). Le CF-EPSC doit montrer une dépression par impulsions appariées et une manière tout ou rien en fonction de l’augmentation de l’intensité de la stimulation. Pour l’induction de la LTD, un seul stimulus doit être utilisé.
- Protocole induisant LTD 1
- À l’aide d’une électrode contenant une solution interne à base de K+ dans des conditions de pince de courant, appliquer simultanément un seul stimulus PF et un seul stimulus CF à 1 Hz pendant 5 min (300 impulsions) (Figure 1A).
- Protocole induisant LTD 2
- À l’aide d’une solution interne à base de K+ contenant une électrode dans des conditions de pince de courant, appliquez des stimuli PF doubles (ISI de 50 ms) et un stimulus CF unique car le deuxième stimulus PF coïncide avec des stimuli CF à 1 Hz pendant 5 min (Figure 1B).
- Protocole induisant LTD 3
- À l’aide d’une électrode contenant une solution interne à base de Cs+ dans des conditions de tension clamp, appliquez un double stimulus PF (ISI de 50 ms) et un seul pas de tension dépolarisante (-70 à 0 mV, 50 ms) au soma à 1 Hz pendant 3 min, de sorte que le deuxième stimulus PF soit équivalent au début du pas de tension de dépolarisation (Figure 1C).
- protocole induisant LTD-4
- À l’aide d’une électrode contenant une solution interne à base de Cs+ dans des conditions de tension clamp, appliquez les stimuli PF (5x à 100 Hz) et un seul pas de tension dépolarisante (-70 à 0 mV, 50 ms) au soma à 0,5 Hz pendant 3 min, simultanément (Figure 1D).
