Un modèle in vitro pour l’étude du passage d’agents pathogènes de la barrière hémato-encéphalique et de l’infection des cellules cérébrales

Résumé

Source : da Costa, A., et al. Un modèle d’interface hémHémato-Brain humain pour étudier les franchissements de barrières par des agents pathogènes ou des médicaments et leurs interactions avec le cerveau. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo présente un modèle in vitro pour étudier les agents pathogènes traversant la barrière hémato-encéphalique (BHE). Les cellules endothéliales microvasculaires, qui expriment des jonctions serrées, forment une couche endothéliale dans la chambre supérieure, tandis que les neurones, les astrocytes et la microglie représentent le parenchyme cérébral dans la chambre inférieure, séparé par une membrane poreuse. L’infection virale dans le modèle de la BHE imite le passage de l’agent pathogène du sang au cerveau. Lors de l’introduction d’un virus neurotrope, il traverse la BHE par transcytose, infecte les cellules neurales, se réplique et libère une descendance virale, démontrant ainsi le succès de la neuroinvasion.

Protocole

1. Construction et contrôle de la qualité du BBB-Minibrain (Barrière hémato-encéphalique - Minibrain) (Figure 1)

1. Mise en place d’un dispositif d’insertion de culture à membrane de polyester BBB-Minibrain (Figure 1B)
   1. Cultivez la lignée de cellules endothéliales du cerveau humain (cellules hCMEC/D3) sur des filtres à insert de culture à membrane polyester à 12 puits pendant 6 jours sur un milieu de cellules endothéliales avant de les utiliser pour l’expérience.
   2. Enduire une plaque à 12 puits de poly-D-lysine (1 mL/puits, 10 μg/mL, 4 h à l’heure de l’art), puis de la laminine (1 mL/puits, 1 μg/mL, toute la nuit à l’artart).
   3. Retirer la laminine et ajouter 1 mL de milieu cellulaire endothélial complété par 5 % de sérum de veau fœtal (FBS) (milieu de cellules endothéliales à 5 %).
   4. Incuber pendant 1 h à 37 °C, 5 % CO₂ et 95 % d’humidité.
   5. Trypsiniser doucement les neurones humains post-mitotiques (hNeurons) et les astrocytes humains (hAstrocytes) (NT2-N/A) et la lignée cellulaire microgliale humaine (CHME/Cl5) et dissocier les granules cellulaires avec un milieu cellulaire endothélial complet.
   6. Comptez les cellules, mélangez 3,6 x 10⁵ NT2-N/A et 0,4 x 10⁵ CHME/Cl5 cellules/puits et ensemencez la plaque de 12 puits.
   7. À T=24 h (24 h après l’ensemencement) : remplacer le milieu utilisé par un milieu de cellules endothéliales complet frais (cellules Minibrain et cellules endothéliales) et transférer le filtre à insert de culture à membrane polyester hCMEC/D3 sur le dessus des cellules Minibrain. Incuber le BBB-Minibrain à 37 °C, 5 % CO₂ et 95 % d’humidité.
      REMARQUE : Le BBB-Minibrain sera alors constitué d’une couche de cellules endothéliales humaines hCMEC/D3 sur filtre isolant le compartiment luminal (ou compartiment « sang ») et d’une culture mixte de cellules humaines hNT2-N/A et hCHME/Cl5 (Minibrain) au fond du puits définissant le compartiment abluminal (ou compartiment « cerveau ») (Figure 1B).
2. Validation de la perméabilité endothéliale du BBB-Minibrain (Quality Control) (Figure 1C)
   1. Préparez le tampon de transport (TB), qui est un tampon HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) avec du Ca²⁺ et du Mg²⁺ complétés par 10 mM d'acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazinéthananesulfonique (HEPES) et 1 mM de pyruvate de sodium.
   2. Préparez des plaques de 12 puits avec 1,5 mL de tampon de transport par puits.
   3. À T = 0, faire un tampon de transport frais complété par 50 μM Lucifer Yellow (LY-TB).
   4. Retournez chaque filtre à l’envers pour retirer soigneusement le milieu sans affecter la barrière cellulaire endothéliale.
   5. Placez le filtre sur la plaque à 12 puits remplie et ajoutez 0,5 mL de LY-TB.
   6. Incuber les plaques dans un incubateur à 37°C, 5 % CO₂ et 95 % d’humidité.
   7. À T=10 min, transférez les filtres sur de nouvelles plaques à 12 puits remplies de TB et conservez le compartiment abluminal de la première plaque pour la lecture du diamètre extérieur.
   8. À T = 25 min, répétez l’étape 1.2.7.
   9. A T= 45 min, arrêtez le transport en retirant les filtres des plaques. Gardez des compartiments abluminal et luminal pour les mesures OD.
   10. Transvasez dans une obscurité des plaques à 96 puits les échantillons : 10 μL avec 190 μL TB pour le LY-TB et les compartiments luminaux, 200 μL d’échantillon pour les compartiments abluminaux.
   11. Mesurer la fluorescence de la LY-TB présente dans les différents échantillons à λ428 nm λ535 nm (ondes d’excitation et d’émission respectivement).
   12. Calculez la perméabilité endothéliale (Pe) vis-à-vis de la TB-LY (Pe_LY) en utilisant la formule :
       1/PSe= (1/PSt) – (1/PSf) et Pe_LY= PSe/S.
       REMARQUE : PSf est la perméabilité du filtre sans cellules, PSt est la perméabilité du filtre avec cellules, PSe est la perméabilité de la monocouche endothéliale chronométrée à la surface de la monocouche, S est la surface de la monocouche (pour un filtre à 12 puits = 1,12 cm²), Pe_LY est exprimée en cm/min. Pour hCMEC/D3, le Pe_LY doit être compris entre 0,7 et 1,2 x 10^-3 cm/min en fonction principalement du FBS utilisé dans les expériences. Important : un Pe_LY supérieur à 1,2 signifie que la BHE n’est pas assez serrée et qu’une certaine fuite peut être observée. Jetez ces barrières.

2. Utilisation de BBB-Minibrain pour mettre en évidence la présence de particules virales neuro-invasives dans un échantillon de vaccin contre le virus de la fièvre jaune, le virus neurotrope français, YFV-FNV 34 (Figure 2)

1. Croisement de la BHE et multiplication des virus de la fièvre jaune dans le Minibrain
   1. Utiliser le BBB-Minibrain préparé comme décrit à l’étape 1.1.7 24 h avant l’ajout du virus ; remplacer le milieu par un milieu de cellules endothéliales FBS à 2 %.
      NOTE : Il est extrêmement important d’éviter de changer de support juste avant d’ajouter le virus. Le changement de milieu peut activer les cellules endothéliales humaines et ouvrir transitoirement la barrière qui permettra le passage du virus. Ici, le support est changé 24 h avant de commencer l’expérience.
   2. À T = 0, ajoutez très soigneusement 3500 unités formant des plaques (PFU) de YFV-FNV diluées dans 50 μL de milieu cellulaire endothélial FBS à 2 % sur le dessus du compartiment luminal. Le contrôle BBB-Minibrain est inoculé avec 50 μL de milieu de cellules endothéliales FBS à 2 % sans virus. Déterminez Pe_LY sur le puits compagnon.
   3. Incuber le BBB-Minibrain dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ et 95 % d’humidité.
   4. Après 24 h, retirer les inserts de culture à membrane de polyester et déterminer Pe_LY, prélever 1 mL dans le compartiment abluminal et titrer le virus. Remplacez le milieu par un milieu frais à 2 % de cellules endothéliales FBS.
   5. Incuber le BBB-Minibrain à 37 °C, 5 % CO₂ et 95 % d’humidité.
   6. Après 72 h, prélever un échantillon du milieu dans le compartiment abluminal et titrer le virus, et/ou extraire l’ARN des cellules du Minibrain pour l’analyse de l’expression génique.

Résultats

Figure 1 : le modèle BBB-Minibrain. A. Calendrier des cultures hCMEC/D3 et photographie du dispositif BBB-Minibrain : un insert de culture à membrane polyester-filtre avec barrière endothéliale hCMEC/D3 est maintenu à l’aide d’une pince avant d’être inséré dans un puits d’une plaque de culture cellulaire de 12 puits. B. Caricature décrivant le dispositif avec le compartiment luminal ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
12 plaques de puits	Corning	336
Boîte de Pétri de 85 mm	Sarstedt	83-3902-500
CHME/Cl5	Unité de Neuroimmunologie Virale	Sur demande auprès du Dr Lafon
CMC	Calbiochem	217274
Assiettes sombres à 96 puits	Corning	3915
DMEM F12	Thermofisher Scientific	31330-038
DMSO	Merck-Sigma Aldrich	Réf. D2650
Endogro IV	Millipore	SCME004
Éthanol	Carlo Erba	529121
FBS	Hyclone	SV30015-04	milieu de cellules endothéliales
HBSS avec Ca2+-Mg2+	Thermofisher Scientific	14025-100
hCMEC/D3	Cedarlane	CLU512
Hepes 1M	Thermofisher Scientific	15630-070
Laminine	Merck-Sigma Aldrich	L6274
L-glutamine	Thermofisher Scientific	25030-024
Lucifer Jaune	Merck-Sigma Aldrich	L0259
MEM 10X	Thermofisher Scientific	21430
MEM 1X	Thermofisher Scientific	42360
Ntera/Cl2D.1	ATCC	CRL-1973
Paraformaldéhyde	Sciences de la microscopie électronique	15714
PBS sans Ca2+-Mg2+	Thermofisher Scientific	14190
PBS-Ca2+-Mg2+	Thermofisher Scientific	14040-091
Stylo/Streptocoque	Eurobio	CXXPES00-07
Poly-d-lysine	Merck-Sigma Aldrich	P1149
Prolonger l’or	Thermofisher Scientific	Réf. P36930
Kit de purification de l’ARN	QIAGEN	74104
Bicarbonate de sodium 5,6 %	Eurobio	CXXBIC00-07
Pyruvate de sodium	Thermofisher Scientific	11360
T75 Cell+ Flau	Sarstedt	83-1813-302	Fiole en polystyrène de culture tissulaire avec traitement de surface spécifique (Cell+) pour cellules adhérentes sensibles
Transwell	Corning	3460	inserts de culture à membrane poreuse polyester
Trypsine-EDTA	Merck-Sigma Aldrich	Réf. T3924
Eau ultra pure	Thermofisher Scientific	10977-035
Versène	Thermofisher Scientific	15040-033	EDTA
YFV-FNV	IP Dakar	Flacon de vaccin