1. Préparation des mouches pour les expériences MultiColor FlpOut (MCFO)
REMARQUE : La technique MCFO fait référence à une version modifiée de ce que l’on appelle l’excision de cassette d’arrêt médiée par Flp (FlpOut). Les mouches MCFO transgéniques sont porteuses d’une recombinase Flp (hsp) et de différents rapporteurs sous contrôle de séquence d’activation en amont (UAS). Chaque rapporteur est constitué d’un squelette commun d’une protéine fluorescente verte myristoylée (myr) super folder (sfGFP), dans laquelle 10 copies d’une étiquette d’épitope (par exemple, HA, FLAG ou V5) ont été insérées. Les protéines non fluorescentes qui en résultent sont appelées « GFP de monstre spaghetti » (smGFP) et peuvent être détectées à l’aide d’anticorps spécifiques contre les différents marqueurs d’épitopes.
- Croise les vols avec la cassette MCFO et le hsp-Flp (hsp-Flp ; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) vers les lignes de pilote gliales GAL4 appropriées (voir le tableau des matériaux).
- Comme le hsp est déjà actif à 25 °C et que peu de cellules peuvent subir une recombinaison conduisant à un marquage non spécifique, mettez en place des croisements à 18 °C afin d’éviter les fuites du système. Attendre environ 20 jours à 18 °C pour obtenir la génération F1. Après le choc thermique (voir l’étape 2), maintenez les mouches à 25 °C (Figure 1).
2. Choc thermique
REMARQUE : Selon le site d’insertion, l’efficacité du hsp-Flp peut différer ; par conséquent, le temps de choc thermique optimal doit être optimisé. Pour ce protocole, un stock de mouches MCFO dans lequel le hsp-Flp a été inséré sur le chromosome X a été utilisé (voir la table des matériaux).
- Transférez la descendance du croisement à l’étape 1.1 (mouches de la génération F1, âgées de 3 à 4 jours) dans de nouveaux flacons contenant de la nourriture et choquez-les thermiquement à 37 °C dans un bain-marie.
note: Les jeunes mouches (1-2 jours) sont très sensibles aux chocs thermiques. Attendre 1 ou 2 jours de plus avant d’effectuer le choc thermique afin de réduire le taux de mortalité causé par le traitement. Utilisez certaines mouches de la génération F1 comme contrôle, sans choc thermique.
- Pendant le choc thermique, maintenez les mouches dans des flacons normaux avec de la nourriture afin de réduire le taux de mortalité induite par le stress. Mettez les femelles et les mâles dans des flacons séparés.
- Assurez-vous d’immerger l’intégralité du flacon dans l’eau pour assurer un choc thermique homogène. Utilisez un choc de 5 à 8 minutes comme point de départ approprié pour le marquage clairsemé de cellules gliales avec de nombreuses lignes de commande GAL4 ; La durée de l’amortisseur doit être optimisée pour chaque pilote et chaque expérience (des temps de choc thermique plus courts ou plus longs peuvent être nécessaires).
- Après le choc thermique, posez les flacons horizontalement sur le banc pendant quelques minutes afin de permettre aux mouches de se remettre du choc thermique.
note: Il n’est pas nécessaire de changer les flacons.
- Maintenez les mouches à 25 °C et disséquez-les (voir étapes 3 et 4) 2 jours ou plus après le choc thermique pour une expression optimale du rapporteur.
3. Préparation et solutions de dissection
- Le jour de la dissection, préparer une solution fixatrice fraîche dans des tubes PCR de 200 μL en mélangeant 180 μL de milieu de culture cellulaire S2 avec 20 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 20 % pour obtenir une solution de PFA à 2 %. Maintenir la solution fixatrice sur de la glace avant et pendant la dissection.
prudence: Le PFA est toxique et doit être manipulé avec précaution.
note: Mélangez 160 μL de milieu de culture cellulaire S2 avec 40 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 20 % dans un tube de réaction en chaîne par polymérase (PCR) de 200 μL pour préparer une solution de PFA à 4 % au lieu d’une solution à 2 %.
- Utilisez un tube PCR par génotype avec un maximum de 8 à 10 cerveaux par tube pour des résultats de coloration optimaux.
- Préparez la solution de lavage de cerveau adulte : 0,5 % d’albumine sérique bovine, 0,5 % de Triton X-100 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
REMARQUE : Selon la coloration, une solution contenant 1 % de Triton X-100 peut être nécessaire. Une concentration plus élevée de Triton X-100 augmente la pénétration de l’anticorps dans les tissus et il est nécessaire de colorer les régions qui se trouvent profondément à l’intérieur du tissu (par exemple, les régions synaptiques dans le cerveau de la drosophile adulte).
- Préparez la solution bloquante : 3 % de sérum de chèvre normal, 3 % de sérum d’âne normal et 0,5 % de Triton X-100 dans du PBS.
- La solution de lavage de cerveau adulte et la solution de blocage peuvent être conservées à 4 °C pendant quelques semaines.
- Placez la plaque de verre des puits de dépression profonde sur de la glace et remplissez chaque puits avec les solutions suivantes : une avec de l’éthanol à 70 %, une avec du PBS et une avec un milieu de culture cellulaire S2.
4. Dissection cérébrale chez l’adulte
- Placez une boîte de dissection de 3 cm sur la platine d’un stéréomicroscope et remplissez-la d’un milieu de culture cellulaire S2 froid. Effectuez toutes les dissections dans ce milieu pour vous assurer que le tissu reste sain pendant la procédure de dissection.
note: Utilisez une parabole de dissection tapissée de plusieurs millimètres de silicone noir qui offre un bon contraste de fond (sur les images), et conservez la pince lors de la dissection.
- Anesthésier les mouches du génotype souhaité avec du CO2.
- À l’aide d’une pince, saisissez la mouche par les ailes et lavez-la dans de l’éthanol froid à 70 % pendant 30 secondes, puis avec du PBS froid pendant 30 secondes supplémentaires.
- Transférez la mouche dans le puits de dépression profonde qui est rempli de milieu de culture cellulaire S2.
- Répétez la même procédure pour toutes les mouches du même génotype et maintenez-les dans un milieu de culture cellulaire S2 froid jusqu’à la dissection, ce qui préservera le tissu.
note: Anesthésie uniquement le nombre de mouches qui peuvent être disséquées dans un délai d’environ 30 minutes. De longs temps d’incubation dans un milieu de culture cellulaire S2 peuvent endommager les tissus.
- Saisissez la mouche à l’aide d’une pince et, sous un stéréomicroscope, immergez-la dans un milieu de culture cellulaire S2.
- Détachez la tête du reste du corps. Jetez le corps et gardez la tête immergée dans le milieu de culture cellulaire S2. Il est extrêmement important de tenir la tête avec une pince pendant toute la durée de la dissection. Si la tête commence à flotter, il sera difficile de la récupérer sans endommager les tissus.
- Commencez la dissection en retirant un œil, tout en tenant la tête avec au moins une pince en tout temps. Assurez-vous que l’extrémité de la pince se trouve juste en dessous de la rétine pour éviter d’endommager les tissus situés en dessous. Retirez l’autre œil et commencez à retirer la cuticule jusqu’à ce que le cerveau apparaisse.
- Retirez tout le tissu trachéal et la cuticule autour du cerveau jusqu’à ce que le tissu semble propre. Assurez-vous d’enlever tout le tissu trachéal autour du cerveau pour des résultats de coloration optimaux ; Les tissus sont maintenant prêts à être fixés et colorés.
- Conservez tous les cerveaux disséqués dans un milieu de culture cellulaire S2 froid avant de les transférer dans la solution PFA afin de chronométrer l’étape de fixation.
5. Coloration du cerveau adulte
- Transférez le cerveau isolé à l’aide d’une pipette P10 dans la solution de PFA à température ambiante (RT). Pour éviter d’endommager les tissus, n’utilisez jamais de pinces pour transférer le cerveau après la dissection. Effectuez toutes les étapes dans des tubes PCR de 200 μL sur un nutator.
- Pour toutes les étapes, avant de jeter l’ancienne solution avec une pipette P200, laissez les cerveaux se déposer au fond du tube. Essayez d’éliminer le surnageant sans aspirer le tissu. Protégez les tissus de l’exposition à la lumière.
- Fixez les cerveaux dans 200 μL de PFA à 2 % dans un milieu de culture cellulaire S2 pendant 1 h ou dans un PFA à 4 % pendant 30 minutes. Maintenir les temps de fixation identiques entre les échantillons afin d’augmenter la reproductibilité.
- Après 3 lavages (ou plus) de 15 minutes chacun dans 200 μL de solution de lavage de cerveau adulte, bloquez les tissus avec 200 μL de solution bloquante pendant 30 minutes. Des temps d’incubation plus longs dans une solution bloquante sont possibles.
- Incuber le cerveau pendant la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires dilués dans une solution de lavage de cerveau adulte dans un volume total de 200 μL.
note: Les temps d’incubation peuvent varier en fonction du type d’anticorps utilisé. Des incubations plus longues peuvent être nécessaires.
- Pour le marquage des trois marqueurs MCFO, incubez les cerveaux avec des anticorps primaires anti-HA (1:500), anti-FLAG (épitope DYKDDDDK) (1:100) et anti-V5.
- Des anticorps primaires directement conjugués pourraient être utilisés à la place de la combinaison primaire + secondaire normale (par exemple, anti-V5 :DyLight 549 (1:200)). Dans ce cas, traitez les anticorps directement conjugués comme des anticorps secondaires.
note: Pour chaque génotype, conservez quelques cerveaux comme témoins afin de vérifier la spécificité de la coloration. Sautez l’incubation primaire de l’anticorps et passez directement à l’étape suivante.
- Lavez les tissus 3 fois pendant 1 h dans 200 μL de solution de lavage de cerveau adulte (étape 3.3) et incubez-les avec des conjugués fluorophores secondaires/anticorps primaires directement conjugués dilués dans une solution de lavage de cerveau adulte pendant une nuit à 4 °C ou pendant 4 h à RT, dans un volume total de 200 μL
note: Exemples d’anticorps appropriés : anticorps conjugués AlexaFluor 488 (1:250), anti-V5 :DyLight 549 (1:200) et DyLight 647 (1:100).
- Lavez la cervelle 3 fois pendant 1 h dans 200 μL de solution de lavage de cerveau adulte, suivie d’un lavage final dans 200 μL de PBS pendant une nuit à 4 °C ou pendant 1 à 2 h à RT ; l’étape finale de lavage dans le PBS élimine toute trace de Triton X-100 et est nécessaire pour des résultats de coloration optimaux. Montez les cerveaux dans un support de montage avec un agent anti-décoloration sur des lamelles en verre.
6. Montage de cerveaux pour l’imagerie
- Coupez une entretoise d’imagerie à la taille appropriée à l’aide de ciseaux. Pour la microscopie à haute résolution, placez l’échantillon et l’espaceur d’imagerie entre deux lamelles en verre.
note: Les intercalaires d’imagerie sont des intercalaires adhésifs minces (0,12 mm d’épaisseur) qui se décollent et se collent aux lamelles de verre ou aux lames de microscope, permettant le montage d’échantillons sans compression.
- À l’aide d’une pince, retirez la doublure adhésive d’une surface et appliquez l’intercalaire, côté adhésif vers le bas, sur la surface d’une lamelle en verre (22 mm x 60 mm). Appliquez 10 μL de support de montage sur une lamelle en verre neuve.
- À l’aide d’une pipette P10, transférez les cerveaux du tube de 200 μL vers la lamelle, à côté de la goutte de support de montage. Avec les tissus, transférez un peu de PBS afin de maintenir les cerveaux en solution.
- À l’aide d’une pipette P10, déplacez les cerveaux du PBS vers la goutte du milieu de montage en essayant de limiter la quantité de PBS. Transférez les échantillons dans le support de montage sur la lamelle à l’aide de l’entretoise d’imagerie. Utilisez suffisamment de support de montage pour couvrir l’échantillon.
- Retirez l’autre doublure adhésive de la partie supérieure de l’entretoise et ajoutez une lamelle en verre sur les échantillons. Avec la pointe d’une pince, appliquez une légère pression sur la zone adhésive à sceller. Imagez immédiatement les tissus montés ou stockez les lames à -20 °C pour une analyse ultérieure.
