Jour 1
1. Marquage des mitochondries des cellules souches mésenchymateuses (CSM)
- Deux jours avant la préparation des mitochondries, semer les CSM humaines dans une boîte cultAure de 100 mm, dans 10 ml (Minimum Essential Medium Eagle)/FBS (Fetal Bovin Serum) 10 %, de manière à avoir 4 x 105 CSM en culture le jour 1.
- Rincer les CSM avec du PBS (4 ml) et ajouter 4 ml d’αMEM/FBS 1 % (préchauffé à 37 °C).
- Ajoutez la quantité requise de colorant vital pour mitochondries et incubez les cellules pendant 30 min dans l’incubateur à 37 °C.
- Retirer la solution de colorant mitochondrial, rincer deux fois les cellules avec 4 ml d’αMEM/FBS 1 % préchauffé (37 °C) et rajouter 4 ml d’αMEM/FBS 10 %. Incuber les cellules à 37 °C.
- Changer le milieu de culture (10 ml αMEM/FBS 10 %) après 30 min et, une autre fois, 2 heures plus tard.
Jour 1
2. Marquage des cellules souches du glioblastome (GSC)
- Dissociation de la lignée cellulaire GSCs Gb4 (10 x 106 cellules) cultivées sous forme de neurosphères sur des flacons de culture cellulaire recouverts de poly-HEMA
- Amorcer les CSG dans une plaque de 48 puits à 105 cellules/puits dans un milieu de prolifération des CSG (500 μl) (voir Tableau 1).
- Centrifuger la plaque à 270 x g pendant 5 min à 20 °C.
- Ajouter la quantité requise de colorant vital cellulaire et incuber pendant 30 min à 37 °C.
- Ajouter 500 μl de milieu basal GSC (Tableau 1) par puits de la plaque de 48 puits.
- Centrifuger la plaque à 270 x g à 20 °C pendant 5 min. Aspirez le surnageant.
- Répétez les étapes 2.5 à 2.6.
- Ajouter 500 μl de milieu de base GSC et incuber à 37 °C pendant 30 min.
- Centrifuger la plaque à 270 x g à 20 °C pendant 5 min. Aspirez le surnageant.
- Ajouter 500 μl de milieu de prolifération de la GSC par puits de la plaque de 48 puits et incuber dans l’incubateur à 37 °C.
Remarque : La quantité de GSC indiquée (10 x 106 cellules) permet d’effectuer les différentes expériences dose-réponse et les contrôles FACS. Une fois que les conditions expérimentales sont définies plus précisément, ce montant peut être réduit.
3. Ensemencement de cellules souches de glioblastome
- Prélever les neurosphères de la GSC (cellules souches du glioblastome) (10 x 106 cellules) par centrifugation à 270 x g pendant 5 min, à 20 °C dans un tube de 50 ml.
- Laver les cellules avec 5 ml de HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) et centrifuger à 270 x g pendant 5 min à 20 °C.
- Aspirez le surnageant.
- Remettre doucement en suspension la pastille de GSC dans 100 μl de trypsine-EDTA (acide éthylènediamine tétraacétique) (0,25 %) (par 10 x 106 cellules)
- Incuber à 37 °C pendant 3 min.
- Ajouter 10 μl de CaCl2 (20 mM) et 2 μl de DNase I (10 mg/ml).
- Dissociez les neurosphères en pipetant doucement de haut en bas (30-50x) avec une pipette P200. Évitez les bulles. Vérifiez au microscope que toutes les CSG sont dissociées.
- Ajouter 10 μl d’inhibiteur de trypsine (5 %) et 10 ml de HBSS.
- Centrifugeuse GSC à 270 x g pendant 7 min à 20 °C.
- Jeter le surnageant et ajouter 10 ml de milieu basal GSC.
- Comptez les GSC à l’aide d’une chambre de comptage Thoma, puis centrifugez les cellules à 270 x g pendant 7 min à 20 °C.
- Ajouter le volume approprié de milieu de prolifération de la GSC pour atteindre la concentration cellulaire de 106 GSCs/ml.
- Graine 105 GSCs (100 μl de suspension cellulaire) par puits d’une plaque de 96 puits.
- Centrifuger les plaques à 270 x g pendant 7 min à 20 °C pour obtenir des GSC au fond des puits.
- Incuber la plaque à 96 puits à 37 °C.
Jour 2
4. Isolement des mitochondries MSC (cellules souches mésenchymateuses)
- Réglez la température de la centrifugeuse à microtubes à 4 °C.
- Préparez deux tubes de 1,5 ml « A » et « C » contenant les réactifs pour l’extraction des mitochondries (200 μl de réactif A et 400 μl de réactif C, tous deux contenant des inhibiteurs de protéase sans EDTA). Préparez 2 autres tubes, étiquetés « MSC » et « Mito ». Gardez tous les tubes sur de la glace. Préparez également des tubes pour les dilutions en série des mitochondries.
- Laver les CSM avec 10 ml de PBS (solution saline tamponnée au phosphate) préchauffé (37 °C).
- Lavez les CSM avec 2 ml de trypsine (sans EDTA) pendant 10 secondes et ajoutez 1 ml de trypsine (sans EDTA). Incuber les cellules pendant 5 à 10 minutes à 37 °C.
- Récupérer les CSM en ajoutant 10 ml d’αMEM /FBS 10 %, transférer dans un tube de 50 ml.
- Cellules de centrifugation à 270 x g pendant 5 min à 20 °C.
- Jetez le surnageant et ajoutez 10 ml d’αMEM/FBS 10 % à la pastille cellulaire.
- Comptez les CSM avec une chambre de comptage Malsuffisant.
- Centrifugeuse MSCs (4-5 x 105) à 270 x g pendant 5 min à 20 °C.
- Jetez le surnageant, ajoutez 1 m d’αMEM/FBS 10 % glacé à la pastille cellulaire et transférez les cellules dans le tube marqué « MSC ». Gardez le tube sur de la glace.
- Centrifuger le tube contenant les CSM à 900 x g pendant 5 min, à 4 °C.
- Retirez tout le fluide résiduel du tube.
- Ajouter 200 μl de réactif d’isolement des mitochondries A (contenant les inhibiteurs de protéase sans EDTA). Vortex à vitesse moyenne pendant 5 secondes et laisser les tubes sur la glace pendant exactement 2 min.
- Ajoutez 2,5 μl de réactif d’isolement des mitochondries B. Vortex à vitesse maximale pendant 10 secondes, puis laissez les tubes sur la glace. Répétez l’opération toutes les 30 secondes pendant 5 min.
- Ajouter 200 μl de réactif d’isolement des mitochondries C (contenant les inhibiteurs de protéase sans EDTA). Mélangez en inclinant le tube (environ 30 fois, ne pas vortex). Centrifuger le tube à 700 x g pendant 10 min à 4 °C.
- Transférez le surnageant (contenant les mitochondries MSC) dans le tube « Mito ».
- Centrifuger à 3 000 x g, 15 min à 4 °C, pour obtenir la pastille de mitochondries. Jetez le surnageant. La pastille contient les mitochondries isolées.
- Rincez la pastille de mitochondrie avec 200 μl de réactif C. Ensuite, centrifugez à 12 000 x g, 5 min à 4 °C, pour obtenir la pastille mitochondriale.
5. Transfert de mitochondries isolées de CSM vers des CSG (MitoCeption)
- Ajouter 200 μl du milieu de prolifération de la GSC pré-refroidi (0 °C) à la pastille de mitochondrie isolée des CSM (4 x 105).
- Diluer la préparation mitochondriale (dans le milieu de prolifération des CSG) pour ajouter systématiquement 20 μl de suspension mitochondriale aux CSG.
- Ajouter le volume de mitochondries isolées dans les puits de la plaque à 96 puits contenant les CSG, à la concentration souhaitée (0,1 à 10 μg). Ajoutez les mitochondries lentement, près du fond du puits, en couvrant toute la surface au moins une fois.
- Centrifuger la plaque à 96 puits contenant les CSG receveuses de mitochondries avec les mitochondries MSC et la plaque de contrôle à 1 500 x g pendant 15 min à 4 °C.
- Placez les plaques de culture dans l’incubateur à 37 °C immédiatement après la centrifugation.
Remarque : Le protocole de transfert de mitochondries repose sur la centrifugation de la suspension de mitochondries sur les cellules cultivées à la force de centrifugation adéquate, avec un nombre de centrifugations qui peut être ajusté en fonction du système de cellules donneuses/receveuses de mitochondries.
Tableau 1 : Milieux de culture.
| Milieu de culture cellulaire | Composition |
| Milieu basal GSC | DMEM/F-12 complété par |
| Insuline 20 mg/ml |
| Supplément N2 1x |
| Glucose 3 g/L |
| L-glutamine 2 mM |
| Moyen de prolifération de la CGG | Ajouter au milieu basal : |
| Supplément B27 1x |
| EGF 10 ng/ml |
| bFGF 10 ng/ml |
| Fongine 10 mg/ml |
| Fungizone 0,25 mg/ml |
| Héparine 2 mg /ml |
| Ciprofloxacine 2 μg / ml |
| Gentamicine 2 μg/ml |
| Support de prolifération du MSC | αMEM complété par |
| L-glutamine 2 mM |
| 10 % FBS |
| bFGF 2 ng/ml |
